Name: הכוונת תרופות לזחל מקרופאגים על ידי הזרקת סמים טעונים ליפוזומים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: למדו שיטה להכוונת תרופות למקרופאגים בזחלי דגי זברה באמצעות הזרקת ליפוזומים טעונים. טכניקה זו מאפשרת לחקור תפקוד מקרופאגים במחלות דלקתיות ולהבין את תרומתם לתהליכים פתולוגיים בביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים שהוענקו C.J.H. (בריאות המועצה של ניו זילנד וקרן מרסדן, החברה המלכותית של ניו זילנד) ו Z.W. (קרן הפקולטה לפיתוח מחקר מאוניברסיטת אוקלנד). המחברים מודים alhad מהפך מהאגקאר עבור ניהול מומחה של מתקן דג זברה, יחידת הדמיה ביו-רפואית, בית הספר למדעי הרפואה, אוניברסיטת אוקלנד לסיוע עם הדמיה קונפוקלית וקד ו גרהם lieschke עבור gifting של Tg (mpeg1: egfp) כתב קו.

1. הכנת ליפוזומים בסמים שנטענו על ידי מרינה בלו
הערה: ליפוזומים הנושאים את צבע הפלורסנט הכחול, מרינה כחול וסמים מוכנים באמצעות שיטת השחות הסרט דק עם החדרת ההודעה של poloxamer 188. כל ההליכים מתבצעים בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. ליפוזומים בקרה מעבירים. רק את מרינה בלו ו-PBS הדוגמה כאן מתארת את טעינת ליפוזומיםעם תרופה נגד נוגדי חמצון המיטו, המשמשת בתוצאות הנציגים כהוכחה למושג.
<ol><li>כדי להכין ליפוזומים, לפזר 16.4 mg (22.2 μpa) של פוספוליפידים 1, 2-dipalmitoyl-sn-גליקו-3- פוספולולין (ראה טבלת חומרים), 4.3 mg (11.1 μov) כולסטרול (ראה טבלת חומרים) ו-2.8 מ"ג (3.7 μמול) 1, 2-מחלת-sn-סופרנובה-3-פוספולינולינה (ראה טבלת חומרים, ב 3 מ ל של כלורופורם: מתנול (3:1 v/v) ב 25 מ"ל בקבוקון עגול.</li>
	<li>לתערובת לעיל, להוסיף 31 nmol של מרינה כחול 1, 2-dihexadecanoyl-sn-פוספוליקו-פוחואטיאנמין (ראה טבלת חומרים) ו 300 nmol של תרופה מעכב mros (ראה טבלת חומרים) ו sonicate לזמן קצר כדי להמיס במלואו. עבור ליפוזומים בקרה, רק להוסיף מרינה כחול 1, 2-dihexadecanoyl-sn-גליליקו-פוספהואטיאנאמין. הערה: כדי למנוע הלבנה של צבע פלורסנט מרינה כחול רגיש לאור, להגן על כל ההליכים מפני אור, היכן שניתן. דבר זה חשוב גם אם התרופה לטעינה היא תלויית-אור.</li>
	<li>הסר את הממס לאט על מאייד רוטרי (ראה טבלת חומרים) על מקלחת טמפרטורה מבוקרת מים להגדיר 45 ° צ' על ידי סיבוב ב 75 סל ד תחת לחץ ואקום (200 mbar עבור 15 דקות ולאחר מכן 0 mbar עבור 20 דקות). זה יוצר סרט יבש השומנים דק בתוך קירות זכוכית של הבקבוקון כי הוא מיובש נוסף עבור 45 דקות תחת N2 כדי להקל על ההסרה המלאה של הממס האורגני.</li>
	<li>לאחר היווצרות של הסרט הדק, להגדיר את הלחץ ואקום כדי 40 mbar עבור 15 דקות, ואז לטהר עם גז חנקן עבור 30 דקות כדי להבטיח הסרה של שאריות הממס.</li>
	<li>מימה את הסרט הדק באמצעות 1 מ ל של מלוחים פוספט באגירה (PBS, pH 7.4) ו חותם עם parafilm לפני הלטרוף את הבקבוקון באמצעות מאייד רוטרי מעל 60 מעלות באמבט מים במשך 20 דקות כדי ליצור שלפוחיות.</li>
	<li>נושא ההשעיה להתייבש 7 מחזורים של הקפאה והפשרה על ידי הקפאת N נוזלי2 עבור 3 דקות ואחריו טבילה באמבט מים 45 ° c עבור 7 דקות.</li>
	<li>הבלטת ליפוזומים באמצעות קרום באמצעות הבלטת ממד (ראו טבלת חומרים) ו-1.0 יקרומטר ממברנות פוליקרבונט מעקב (ראה טבלת חומרים) עבור 2-6 מחזורים כדי להשיג unilamellar שלפוחיות גדולות. הערה: כדי להשיג התמקדות חיובית יותר כלפי מקרופאגים, לטפל מחזורים ההבלטה עד קוטר של ליפוזומים הוא כ 1 יקרומטר26,27,28.</li>
	<li>לדחוס את ליפוזומים טריים לתוך כדור על ידי מיקוד ב 186,000 x g ו-מארג עם 1 מ ל של 1% poloxamer 188 (ראה טבלת חומרים) פתרון (10 מ"ג/mL ב-PBS) ב 45 ° צ' ו 750 rpm עבור 30 דקות באמצעות thermomixer עם מצורף 2 מ"ל שפופרת מיקרוצנטריפוגה (ראה לוח חומרים).</li>
	<li>Ultracentrifuge את התערובת ב 186,000 x g עבור 1 h ב 4 ° c ולהסיר את supernatant כדי להסיר פולימר או תרופה לא מאוגד. לאחסן את כדורי ליפוזומים ב -4 ° c, מוגן מפני אור.</li>
</ol>2. אפיון ליפופי גודל ופוטנציאל זטה
<ol><li>לדלל ליפודי ניסוח עם מים באולטרסאונד (1:100) ולמדוד את גודל החלקיקים, המדד הפולידיפיטיות (PDI) ו זטה פוטנציאל של ליפוזומים באמצעות מנתח פיזור אור דינמי (ראה טבלת חומרים), בטריליפיאט ב -25 ° c. הערה: ה-PDI הוא מדד לפיזור הגודל של האוכלוסיה הננו-חלקיק. ערכי PDI < 0.05 מציין התפלגות אחידה יותר בעוד שהערכים הקרובים ל-1 מצביעים על התפלגות גודל גדולה יותר. פוטנציאל הזטה הוא. המטען הכולל של השטח</li>
</ol>3. חישוב יעילות מלכודת והעמסה של סמים בליזומים
הערה: כדי לקבוע את יעילות המלכוד של התרופה ליפוזומים, תכולת התרופה הכלולה בסופרנטאנט וליפוכי הגלולה נמדדת.
<ol><li>להשעות את הגלולה בתוך 1 מ ל של PBS.</li>
	<li>מסירים את הסופרנטאנט, מדלל 10 x עם מים באולטרטהורים ומנתחים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים.</li>
	<li>כדי לקבוע את ריכוז התרופה בתוך ליפוזומים, להוסיף 100 μL של ליפוכי ההשעיה כדי 900 μL של 10% טריטון-X100 פתרון (כדי להרוס את קרום השומנים, שחרור התרופה לכוד ומניעת השומנים לבנות בתוך העמודה ולאחר מכן) ומערבולת עבור 3 דקות לפני הניתוח.</li>
	<li>הכנס 20 μl של מדגם לתוך מערכת המערכת המורכבת של משאבת הרביעון, התרמוסטט אוטומטי-דוגם ו 3 יקרומטר 250 x 4.6 mm עמודה. הגדר את השלב הנייד (10 mM PBS pH 2.5, acetonitrile ו מתנול (30:40:30, v/v/v)) שיעור הזרימה 0.9 mL/min ולהשיג פרופילים ספקטרליים באמצעות גלאי מערך דיודה להגדיר ב 230 mM.</li>
	<li>לחשב את יעילות מלכודת (הנדסת חשמל) והעמסת סמים (DL) באמצעות המשוואות הבאות: EE (100%) DL (100%) כאשר אני המסה של התרופה המאסיבית, Mt הוא מסה כוללת של התרופה המשמשת במהלך ניסוח ו-Mlip הוא מסה כוללת של השומנים (כולל כולסטרול) ותרופות שעברו אנקפסולציה.</li>
</ol>4. הכנה והזרקה של ליפוזומים
<ol><li>הכנת בורוסיליקט מחטים מיקרו הזרקה על ידי החדרת הקיר דק בורוסיליקט זכוכית נימי (1 מ"מ מנת יתר x 0.78 מ"מ זיהוי x 10 ס מ אורך) לתוך מכשיר פולר מיקרופיפטה (ראה טבלת חומרים) עם הגדרות הפולר הגנרית הבאים (חום 680, משוך 75, מהירות 40, זמן 55 ולחץ 530)</li>
	<li>מניחים את המחטים לתוך צלחת פטרי על חימר הדוגמנות ולסדר בדרך כי הסיום הוא לא נוגע בתחתית המנה. שמרו על מכסה הצלחת פטרי סגור כדי למנוע זיהום אבק עד שהוא מוכן לשימוש.</li>
	<li>לדלל טרי-מוכן ליפוכמה ניסוחים 1:1 ב-PBS סטרילי (pH 7.4) ובקצרה מערבולת (2-3 s) כדי לערבב. הערה: הגנו על ליפוזומים מהאור עד שהזחלים יהיו מוכנים להזרקה.</li>
	<li>כוונן זוגות מבוגרים של הרבייה דגים בלילה לפני ולאסוף את העוברים כפי שתוארו בעבר על ידי רוזן ואח '29.</li>
	<li>להעביר את העוברים לתוך צלחת פטרי (100 מ"מ x 20 מ"מ בסגנון עם כ 60 עוברים לכל מנה) המכיל E3 בינוני (5 מ"מ הנאגל, 0.17 מ"מ KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 Mm MgSO4) שיושלם עם 0.1% מתילן כחול לעכב צמיחה פטרייתיים. הסירו את כל העוברים המתים או הבלתי מופרות במשך הלילה ב-28.5 ° c.</li>
	<li>כדי להקל על הדמיה חיה, להוסיף 0.003% N-פניylourea (ptu) לתוך E3 מדיה כאשר העוברים להגיע 24 h של פיתוח כדי למנוע היווצרות פיגמנט (מלאניזציה).</li>
	<li>באופן ידני לביטול העוברים ב כ 30 h הפריה הפוסט (hpf) באמצעות מלקחיים טיפ עדין. הערה: אין להשתמש בטיפול אנזימטי לעוברי הדאוורגון, העלולים לגרום נזק לאפיתל ולדלקת מקומית ובכך להשפיע על לימודים אימונולוגיים.</li>
	<li>תנו לעוברים להתפתח ב-28.5 ° צ' עד 2 ימים לאחר ההפריה (dpf).</li>
	<li>להכין צלחת זריקה על ידי שפיכת 3% מתיל תאית (ב E3 מדיה) לתוך המכסה של מאכל קטן 35 mm התרבות כדי ליצור סרט דק המכסה את המשטח כולו. הערה: בעת הכנת 3% מתיל תאית ב E3 מדיה, זה לוקח כמה ימים עבור מתיל תאית להתמוסס עם עצבנות עדינה על שייקר מסלולית.</li>
	<li>הרדים הזחלים על ידי דגירה ב E3 מדיה בתוספת עם 200 μg/mL של Tricaine.</li>
	<li>לאסוף בריכה של כ 20-25 הזחלים באמצעות פיפטה העברה פלסטיק ולאפשר לעוברים להתרכז בקצה של הפיפטה על ידי כוח הכבידה. מטפל להעביר את הזחלים עם נוזל מינימלי, למקם אותם באמצע המכסה של מכסה התרבות 35 מ"מ.</li>
	<li>באמצעות מטעין מיקרונימי, לסדר את הזחלים בדרכים הבאות: קדמית לקראת החלק העליון של צלחת ההזרקה עם המשטח הקדמי פונה לכיוון המחט מיקרוהזרקה, כדי להזריק לתוך החדר הקדמי המוח (איור 2a-D); או, הקדמי לכיוון שמאל של לוחית ההזרקה (בעת הזרקת מימין) עם המשטח הגחוני פונה לכיוון המחט מיקרוהזרקה כדי להזריק לתוך venosus הסינוס (איור 2I). הערה: כאשר מוזרק בדרך זו, המוח השחדר לחדר-תושב (איור 2E) ו הרקמה המטודתית (CHT)-תושב (איור 2J) מקרופאגים ניתן לפלח, בהתאמה. אזור הCHT של הזחל הוא אתר המטפטי הדומה לכבד העוברי של היונקים. לשים לב בנוסף לא לפגוע העוברים תוך הסדרת כי זה עלול לגרום לדלקת מקומית ובכך להשפיע על לימודים אימונולוגיים.</li>
	<li>לקחת ליפוזומים טרי (משלב 4.3) ובחזרה למלא מחט הזריקה עם כ 5 μL של ליפוכמה לערבב הזרקה באמצעות מטעין מיקרונימי (ראה טבלת חומרים). הערה: בעת הערכת הלוקליזציה של ליפוזומים לתאי phagolysoזומאים של מקרופאגים (איור 2H), תוספת זו לערבב הזרקה עם 200 μg/mL של סמן פלורסנט אדום של phagoזומים (ראה טבלה של חומרים) ו 100 nM של סמן פלורסנט אדום רחוק של lysosomes (ראה טבלת חומרים) כדי לסמן phagoזומים30,31 ו lysosomes32, בהתאמה.</li>
	<li>טעינת המחט לתוך מיקרומניפולציה (ראו טבלת חומרים) המחוברת למעמד מגנטי ומזרק ללחץ (ראו לוח חומרים). מיקום תחת stereomicroscope ולהגדיר את מזרק על משך הדופק של כ 50 ms ו לחץ הזרקה של כ 40 psi.</li>
	<li>חותכים את הקצה של המחט מיקרוהזרקה עם מלקחיים משובחים בסדר תשר כדי ליצור פתיחה של כ 5 יקרומטר קוטר.</li>
	<li>כיול את עוצמת הקול המוזרקת על-ידי הזרקת מנת ההזנה לתוך טיפה של שמן מינרלי הממוקם מעל קווי הרשת של הומוציטוטומטר. כוונן את משך הפעימה ו/או לחץ ההזרקה עד שקוטרו של ההזנה מכסה 2.5 של קווי הרשת הקטנים ביותר (זה מתאים לנפח של כ-1 nL).</li>
	<li>בזהירות להזריק 1 nL של ליפוכמה לערבב הזרקה לתוך החדר המוח השמאלי של כל הזחלים. הערה: כאשר מזריקים לחדר האחורי של המוח האחורי, יש לדאוג לא לחדור מרחוק מדי (מעבר לראש המוח), שכן הדבר עלול לשבש את היסוד המוביל לדימום. כאשר מזריקים לתוך venosus הסינוס, יש לנקוט כדי להבטיח את קצה המחט הוא רק בתוך קרום הלב ולא חודר את החלמון.</li>
	<li>לאחר ההזרקה, העבר מיד את הזחלים המוזרקים חזרה לתוך E3 מדיה על ידי הוספת E3 מדיה לצלחת ההזרקה בעדינות להפוך את הזחלים מתוך התאית מתיל באמצעות פיפטה העברה פלסטיק.</li>
	<li>מודגנת את הזחלים ב 28.5 ° צ' (מוגן מפני אור) עד לניתוח על ידי הדמיה מיקוד חי.</li>
</ol>5. הדמיה confocal וקד וניתוח תמונה כדי לאשר מקרופאג פילוח של ליפוזומים
<ol><li>מחממים אמבט מים עד 50 ° c.</li>
	<li>הרדים ליפופי מוזרק הזחלים על ידי העברת תבשיל Perti חדש המכיל E3 מדיה בתוספת 0.003% PTU ו 200 μg/mL Tricaine.</li>
	<li>להכין הדמיה חיה הרכבה בינונית על ידי המסת 1% התכה נמוכה agarose ב E3 מדיה, שיושלם עם 0.003% PTU, במיקרוגל. מקום באמבט מים ופעם הפתרון מקורר 50 ° c, להוסיף 200 μg/mL של Tricaine.</li>
	<li>שמרו על מדיום ההרכבה באמבט המים 50 ° c כדי למנוע פילמור מוקדם של הצמח.</li>
	<li>כדי לדמות את המשטח החלק הפנימי של המוח השטרם על מיקרוסקופ קונפוקלית וקד מצויד בעדשה טבילה מים (איור 2E), להטביע את הזחלים כדלקמן: למלא את הגידול 35 mm עם בינוני הרכבה (לעומק של כ 5 מ"מ) ולתת לו לפולימו. חפירת תעלה קטנה ב-agarose, כי הוא בגודל מספיק כדי להכיל את שק החלמון.</li>
	<li>מילוי פיפטה להעברת פלסטיק עם מדיום הרכבה מותכת, לגרש כמות קטנה, ולהשתמש בו כדי לאסוף את הזחלים רדימים. העבירו מיד את הזחלים לתוך קערת התרבות, והפכו את שקי החלמון למטה, לתוך החורים שנחפרו, בעזרת מטעין מיקרונימי. מדי פעם שומרים אותם בתנוחה הזאת עד שהוא התעורר. כיסוי עם E3 מדיה בתוספת עם 200 μg/mL Tricaine. הערה: בעת העברת ומיקום הזחלים, לדאוג לא לגרום נזק אפיתל ודלקת מקומית אשר יכול להשפיע על לימודים אימונולוגיים. לצורך מיקום הזחלים לחיות תמונה באזור CHT (איור 2J), הר כפי שמתואר לעיל, אלא למקם את הזחלים בתוך החור שנחפר בחפירות.</li>
	<li>כאשר הדמיה על המיקרוסקופ קונפוקלית וקד הפוך, להטביע את הזחלים, ללא מיטה agarose, ישירות על החלק התחתון של הצלחת התחתונה זכוכית. מסדרים אותם למטה (או מתחת למים) ובעקבות הפלמור, כסו את משטח הכלים כולו עם שכבה אפילו של מדיום. לאחר הפילמור, להוסיף שכבה דקה של E3 מדיה בתוספת עם 200 μg/mL של Tricaine.</li>
	<li>כדי לחיות את התמונה החדר השמאלי המוח על מיקרוסקופ קונפוקלית וקד, להשתמש בהגדרות הבאות: 512 x 512 פיקסלים; 40 x 3 יקרומטר Z-ערימות (הארכת מן המשטח הפנימי ביותר של המוח המוחלק); המטרה 20x; 2.5 x זום. הערה: בעת השוואת עוצמות האות בין דגימות (לדוגמה, בעת הדמיה של קליטת ליפוזומים מרינה כחול המוזרקים בתוך קווי הכתב לסמן את מקרופאגים [Tg (mpeg1: egfp)33] או נויטרופילים [Tg (lyz: egfp)34]), חיוני כי הגדרות לייזר נשמרות זהה (למשל, בקוטר חריר, מתח לייזר, היסט ולהרוויח) כדי לסייע להבטיח כל הבדלים אינם פריט של הגדרות רכישת תמונה משתנה.</li>
	<li>השתמש 3D ניתוח תמונה התוכנה כדי לכמת מקרופאג או הספיגה נויטרופילים של מרינה כחול התווית ליפוזומים. כדי לכמת את מספר התאים המכילים ליפוזומים (איור 2F) בתוך z-מחסנית, לגלול בסעיפים z בודדים ולספור את מספר התאים הבודדים המכילים ליפוזומים מרינה כחול התווית. כדי לכמת את העוצמה הפלואורסצנטית של ליפוזומים בתוך תאים (איור 2G), לצייר אזור של עניין סביב כל תא (ב X, Y ו-Z ממדים) כדי לכמת את העוצמה הכוללת או מתכוון הזריחה של מרינה כחול תאיים.</li>
</ol>

<ol><li>Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+mononuclear+phagocyte+system+in+the+molecular+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).</li>
<li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li>
<li>Krenkel, O., Tacke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+macrophages+in+tissue+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Liver macrophages in tissue homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (5), 306-321 (2017).</li>
<li>Alderton, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+immunology%3A+turning+macrophages+on%2C+off+and+on+again%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tumour immunology: turning macrophages on, off and on again.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 136-137 (2014).</li>
<li>Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+atherosclerosis%3A+a+dynamic+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (10), 709-721 (2013).</li>
<li>Lawrence, T., Natoli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+macrophage+polarization%3A+enabling+diversity+with+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of macrophage polarization: enabling diversity with identity.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 750-761 (2011).</li>
<li>Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-mediated+inflammation+in+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 738-749 (2011).</li>
<li>Renshaw, S. A., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+450+million+years+in+the+making%3A+zebrafish+and+vertebrate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+models+and+mechanisms%22%5BJournal%5D)">A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity.</a> Disease models and mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).</li>
<li>Hall, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoresponsive+gene+1+augments+bactericidal+activity+of+macrophage-lineage+cells+by+regulating+beta-oxidation-dependent+mitochondrial+ROS+production%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Immunoresponsive gene 1 augments bactericidal activity of macrophage-lineage cells by regulating beta-oxidation-dependent mitochondrial ROS production.</a> Cell Metabolism. 18 (2), 265-278 (2013).</li>
<li>Hall, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+fatty+acid-fueled+mROS+production+within+macrophages+alleviates+acute+gouty+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Blocking fatty acid-fueled mROS production within macrophages alleviates acute gouty inflammation.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 1752-1771 (2018).</li>
<li>Cambier, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacteria+manipulate+macrophage+recruitment+through+coordinated+use+of+membrane+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids.</a> Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).</li>
<li>Davis, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).</li>
<li>Madigan, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Macrophage+Response+to+Mycobacterium+leprae+Phenolic+Glycolipid+Initiates+Nerve+Damage+in+Leprosy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Macrophage Response to Mycobacterium leprae Phenolic Glycolipid Initiates Nerve Damage in Leprosy.</a> Cell. 170 (5), 973-985 (2017).</li>
<li>Tobin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lta4h+locus+modulates+susceptibility+to+mycobacterial+infection+in+zebrafish+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans.</a> Cell. 140 (5), 717-730 (2010).</li>
<li>Volkman, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuberculous+granuloma+induction+via+interaction+of+a+bacterial+secreted+protein+with+host+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tuberculous granuloma induction via interaction of a bacterial secreted protein with host epithelium.</a> Science. 327 (5964), 466-469 (2010).</li>
<li>Bowman, T. V., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swimming+into+the+future+of+drug+discovery%3A+in+vivo+chemical+screens+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Swimming into the future of drug discovery: in vivo chemical screens in zebrafish.</a> ACS Chemical Biology. 5 (2), 159-161 (2010).</li>
<li>Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genetic+screening+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chemical genetic screening in the zebrafish embryo.</a> Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).</li>
<li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).</li>
<li>Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+and+nanoparticles%3A+nanosized+vehicles+for+drug+delivery+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 30 (11), 592-599 (2009).</li>
<li>Torchilin, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+with+liposomes+as+pharmaceutical+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (2), 145-160 (2005).</li>
<li>Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stealth+liposomes%3A+review+of+the+basic+science%2C+rationale%2C+and+clinical+applications%2C+existing+and+potential%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential.</a> International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).</li>
<li>Astin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+cells+and+bacterial+infection+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Innate immune cells and bacterial infection in zebrafish.</a> Methods in Cell Biology. 138, 31-60 (2017).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-insertion+of+poloxamer+188+strengthened+liposomal+membrane+and+reduced+drug+irritancy+and+in+vivo+precipitation%2C+superior+to+PEGylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Post-insertion of poloxamer 188 strengthened liposomal membrane and reduced drug irritancy and in vivo precipitation, superior to PEGylation.</a> Journal of Controlled Release. 203, 161-169 (2015).</li>
<li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome-Mediated+Drug+Delivery+in+Larval+Zebrafish+to+Manipulate+Macrophage+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Liposome-Mediated Drug Delivery in Larval Zebrafish to Manipulate Macrophage Function.</a> Zebrafish. 16 (2), 171-181 (2019).</li>
<li>Cader, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C13orf31+%28FAMIN%29+is+a+central+regulator+of+immunometabolic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">C13orf31 (FAMIN) is a central regulator of immunometabolic function.</a> Nature Immunology. 17 (9), 1046-1056 (2016).</li>
<li>Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+particle+size+on+drug+delivery+to+rat+alveolar+macrophages+following+pulmonary+administration+of+ciprofloxacin+incorporated+into+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Drug+Targeting%22%5BJournal%5D)">Influence of particle size on drug delivery to rat alveolar macrophages following pulmonary administration of ciprofloxacin incorporated into liposomes.</a> Journal of Drug Targeting. 14 (8), 557-566 (2006).</li>
<li>Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+characteristics+of+liposomes+by+rat+alveolar+macrophages%3A+influence+of+particle+size+and+surface+mannose+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmact+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Uptake characteristics of liposomes by rat alveolar macrophages: influence of particle size and surface mannose modification.</a> Journal of Pharmact and Pharmacology. 59 (1), 75-80 (2007).</li>
<li>Chono, S., Tauchi, Y., Morimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+particle+size+on+the+distributions+of+liposomes+to+atherosclerotic+lesions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Development+and+Industrial+Pharmacy%22%5BJournal%5D)">Influence of particle size on the distributions of liposomes to atherosclerotic lesions in mice.</a> Drug Development and Industrial Pharmacy. 32 (1), 125-135 (2006).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).</li>
<li>Hall, C., Flores, M. V., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+zebrafish+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of zebrafish leukocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 255-271 (2009).</li>
<li>Kapellos, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+real+time+imaging+platform+to+quantify+macrophage+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A novel real time imaging platform to quantify macrophage phagocytosis.</a> Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).</li>
<li>Shen, K., Sidik, H., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rag-Ragulator+Complex+Regulates+Lysosome+Function+and+Phagocytic+Flux+in+Microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The Rag-Ragulator Complex Regulates Lysosome Function and Phagocytic Flux in Microglia.</a> Cell Reports. 14 (3), 547-559 (2016).</li>
<li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), 49-56 (2011).</li>
<li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42(2007).</li>
<li>Ahsan, F., Rivas, I. P., Khan, M. A., Torres Suarez, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+to+macrophages%3A+role+of+physicochemical+properties+of+particulate+carriers--liposomes+and+microspheres--on+the+phagocytosis+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Targeting to macrophages: role of physicochemical properties of particulate carriers--liposomes and microspheres--on the phagocytosis by macrophages.</a> Journal of Controlled Release. 79 (1-3), 29-40 (2002).</li>
<li>Martin, W. J., Walton, M., Harper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+macrophages+initiating+and+driving+inflammation+in+a+monosodium+urate+monohydrate+crystal-induced+murine+peritoneal+model+of+acute+gout%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Resident macrophages initiating and driving inflammation in a monosodium urate monohydrate crystal-induced murine peritoneal model of acute gout.</a> Arthritis and Rheumatology. 60 (1), 281-289 (2009).</li>
<li>Faires, J. S., McCarty, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+arthritis+in+man+and+dog+after+intrasynovial+injection+of+sodium+urate+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Acute arthritis in man and dog after intrasynovial injection of sodium urate crystals.</a> Lancet. 280, 682-685 (1962).</li>
<li>Martin, W. J., Harper, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+inflammation+and+resolution+in+acute+gout%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Innate inflammation and resolution in acute gout.</a> Immunology and Cell Biology. 88 (1), 15-19 (2010).</li>
<li>Fenaroli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+as+drug+delivery+system+against+tuberculosis+in+zebrafish+embryos%3A+direct+visualization+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles as drug delivery system against tuberculosis in zebrafish embryos: direct visualization and treatment.</a> ACS Nano. 8 (7), 7014-7026 (2014).</li>
<li>Robertson, J. D., Ward, J. R., Avila-Olias, M., Battaglia, G., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Neutrophilic+Inflammation+Using+Polymersome-Mediated+Cellular+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Targeting Neutrophilic Inflammation Using Polymersome-Mediated Cellular Delivery.</a> Journal of Immunology. 198 (9), 3596-3604 (2017).</li>
<li>Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+development+in+bony+fish+with+particular+emphasis+on+collagen+deposition+in+the+dermis+of+the+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio).</a> International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).</li>
<li>Kelly, C., Jefferies, C., Cryan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+liposomal+drug+delivery+to+monocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Targeted liposomal drug delivery to monocytes and macrophages.</a> Journal of Drug Delivery. 2011, 727241(2011).</li>
<li>Fidler, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+liposomes+to+improve+delivery+of+macrophage-augmenting+agents+to+alveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Design of liposomes to improve delivery of macrophage-augmenting agents to alveolar macrophages.</a> Cancer Research. 40 (12), 4460-4466 (1980).</li>
<li>Ng, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+digestive+system+in+zebrafish%3A+III.+Intestinal+epithelium+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmenal+Biology%22%5BJournal%5D)">Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis.</a> Developmenal Biology. 286 (1), 114-135 (2005).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי לא קיימים אינטרסים פיננסיים מתחרים.

כאן, סיפקנו פרוטוקול מפורט כדי לנסח ליפוזומים בסמים שנטענו למטרה במיוחד מקרופאגים בזחל החוצה. שיטה זו יכולה לשמש כדי לנתח את התפקיד של מקרופאגים במודלים של מחלות מסוימות על ידי הבטחת מסירת ממוקדות ישירה של תרופות במיוחד מקרופאגים. כמו-כן, ניתן להשתמש בה כאשר רעילות כללית של סמים מגבילה את השימוש בהם כאשר הם מועברים על ידי נתיבים קונבנציונליים יותר, כמו טבילה. הפרוטוקול המתואר כאן מספק אלטרנטיבה למערכות nanoparticulate אחרות, ששימשו למטרת מטרה בתאי החיסון המוולדים בזחל-דג. אלה כוללים מיקוד גריסופלובין התרופה מלריה, כדי מק...

מערכת פגוציט מספק קו ההגנה הראשון נגד הפולשים פתוגנים. מערכת זו מורכבת מונוציטים, תאים דנדריטים מונוציט נגזר ו מקרופאגים, אשר באופן פעיל phagocytoze פתוגנים זרים, ובכך להגביל את התפשטות הפתוגן. בנוסף לפונקציות אלה phagocytic ו microbicidal התאים הדנדריטים מקרופאגים הם גם מסוגלים ייצור cy, אנטיגן-מצגת כדי להפעיל את המערכת החיסונית אדפטיבית1. של תאים אלה, מקרופאגים קיבלו תשומת לב מיוחדת בשל טרוגניות תפקודית מגוונת שלהם ומעורבות מחלות דלקתיות מרובות, מ חסינות אוטומטית מחלות זיהומיות לסרטן2,3,4,5,6,7. הפלסטיות של מקרופאגים ויכולתם להסתגל מבחינה פונקציונלית לצרכים בסביבת הרקמה שלהם מחייבת גישות נסיוניות להתבונן ישירות ולחקור תאים אלה בvivo.
זחל זהפיש הם אורגניזם מודל אידיאלי שדרכו ללמוד את הפונקציה ואת הפלסטיות של מקרופאגים ב vivo8. השקיפות האופטית של זחל דג זברה מספק חלון כדי להתבונן ישירות התנהגות של מקרופאגים, במיוחד כאשר ביחד עם קווי הכתב הטרנסגניים מקרופאג. ניצול פוטנציאל ההדמיה החי ואת היכולת הניסיונית של זחל הדגים הובילו לתובנות משמעותיות רבות לפונקציה מקרופאג שיש להן רלוונטיות ישירה למחלה האנושית9,10,11,12,13,14,15. רבים ממחקרים אלה ניצלו גם את היתרון של שימור גבוה של פעילות הסמים ב-דג זברה (תכונה המסופינים השימוש שלהם בתור בעלי חיים לגילוי התרופה שלמה16,17,18), על ידי ניצול התערבויות כימיות כדי פרמקולוגית לטפל מקרופאג פונקציה. עד כה, טיפולים תרופתי אלה נמסרו בעיקר באמצעות טבילה, אשר דורש את הסם להיות מסיסים במים, או על ידי מיקרוהזרקה ישירה של תרופה חופשית (איור 1א). מגבלות אלה אסטרטגיות מסירה פסיבית כוללים אפקטים מחוץ ליעד ורעילות כללית העלולה למנוע הערכה כל השפעה על מקרופאג function. בנוסף, כאשר חקירת תופעות התרופה על מקרופאגים זה לא ידוע אם הסמים פועלים על מקרופאגים עצמם או באמצעות מנגנונים עקיפים יותר. בעת ביצוע התערבות כימית דומה במחקרים לחקור פונקציה מקרופאג, הכרנו היה צורך לא מוכר לפתח שיטת משלוח זולה וישירה כדי למקד את התרופות במיוחד מקרופאגים.
ליפוזומים הינם מיקרוסקופיים, ביולוגיים, בעלי שומנים מיקרוסקופים, שיכולים לכמס חלבונים, נוקלאוטידים ומטענים של סמים19. מבנה השומנים הunilamellar או רב-לאמצ'יני במבנה של ליפוזומים מהווה לומן פנימי מימית שבו ניתן לשלב תרופות מסיסים במים בעוד תרופות הידרופובי ניתן לשלב בקרומים השומנים. בנוסף, המאפיינים הפיזיקליים של ליפוזומים, כולל גודל, חיוב ושינויי פני שטח ניתן לתמרן כדי להתאים את המיקוד שלהם לתאים ספציפיים20,21. תכונות אלה של ליפוזומים עשו להם רכב אטרקטיבי לספק סמים ולשפר את הדיוק של הטיפול הנוכחי משטרי20. כמו ליפוזומים הם באופן טבעי phagocytozed על ידי מקרופאגים (תכונה מנוצלת על ידי שימוש שגרתי שלהם באספקת clodronate במיוחד מקרופאגים עבור ניסויים אבלציה22), הם מציגים כאופציה אטרקטיבית עבור משלוח סמים ספציפי מקרופאג (איור 1B).
פרוטוקול זה מתאר את הניסוח של תרופות ליפוזומים כחול פלורסנט מצופה עם הידרופילי פולימר poloxamer 188, כי צורות שכבת הגנה על ליפוכמה משטח והוכח כדי לשפר את שמירת הסמים יש ביולוגי מעולה23. Poloxamer נבחרה לציפוי פני השטח של ליפוזומים כמו המחקר הקודם שלנו הראו כי, כאשר לעומת פוליאתילן גליקול שונה ליפוזומים, poloxamer שונה ליפוזומים הראה תאימות ביולוגית טובה יותר בעקבות הזרקה תת עורית של כפות הראש ואת פרמקוקינטיקה דומה בארנבים בעקבות עירוי אינפוזיה23. הפרוטוקולים מתוארים גם עבור המיקרו ההזרקה שלהם לתוך זחל הדמיה חיה להעריך את היכולת המקרופאג שלהם ולוקליזציה לתאים תאיים הנחוצים ליפוכמה השפלה ומשלוח תרופות cytoplasmic. כהוכחה-of-קונספט בעבר השתמשנו בטכניקה זו כדי למקד שתי תרופות מקרופאגים כדי לדכא את ההפעלה שלהם במודל זחל דג זברה של דלקת gouty חריפה24. טכניקה זו מסירת סמים מרחיבה את "ערכת הכלים" הכימית הזמינה לחוקרי דג זברה המבקשים להבטיח מקרופאג-פילוח של תרופות הריבית שלהם.

<table><tbody><tr><td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850355P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE)</td> <td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850367P</td><td></td></tr><tr><td>1.0 ומיקרו; m Whatman Nuclepore ממברנות פוליקרבונט חרוטות מסלול</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>110610</td><td></td></tr><tr><td>25 מ"ל בקבוק תחתון עגול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z278262</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית 35 מ"מ</td><td>Thermo Scientific</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1260 גלאי מערך דיודות אינפיניטי</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4212B</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1311B</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1290 Infinity Series Thermostat</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1330B</td><td></td></tr><tr><td>Avanti מיני אקסטרודר Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>אוונטי פולאר ליפידים בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחטי מיקרו הזרקת בורוסיליקט</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>203-776-0664</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C4901-100G</td><td></td></tr><tr><td>כולסטרול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>דומונט מס' 5 מלקחיים בקצה עדין</td><td>כלים מדעיים</td><td>עדינים 11251-10</td><td></td></tr><tr><td>אפנדורף מיקרו-מעמיס קצה פיפטה</td><td>אפנדורף</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf SmartBlock 1.5 מ"ל, תרמובלוק ל-24 כלי תגובה</td><td>Eppendorf</td><td>4053-6038</td><td></td></tr><tr><td>מניפולטור ריסים</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>113</td><td></td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td>Hawksley</td><td>BS.748</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BDH Chemicals</td><td>441474J</td><td></td></tr><tr><td>מערכת HPLC</td><td>Agilent Technologies</td><td>1260 סדרת HPLC מערכת</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-1KG</td><td></td></tr><tr><td>נקודת התכה נמוכה agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker אדום עמוק</td><td>Invitrogen</td><td>L12492</td><td>פתרון מלאי 1 מ"מ ב-DMSO, שמור על -20 &deg; C ולהגן מפני אור.</td></tr><tr><td>LysoTracker אדום</td><td>עמוק Thermo Scientific</td><td>L12492</td><td></td></tr><tr><td>מעמד מגנטי</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>מרינה כחול 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE)</td> <td>Invitrogen</td><td>M12652</td><td>שמור על -20 מעלות; C ולהגן מפני אור.</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>מתיל צלולוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M0387-500G</td><td></td></tr><tr><td>מתילן כחול</td><td>אלפא Aesar</td><td>42771</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>230391-500G</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M-3516</td><td></td></tr><tr><td>נוגד חמצון ממוקד מיטוכונדריה MitoTEMPO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0737</td><td></td></tr><tr><td>MitoSOX מחוון סופראוקסיד מיטוכונדריאלי אדום</td><td>Thermo Scientific</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>MitoTEMPO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0737</td><td>לשמור על -20 מעלות; C ולהגן מפני אור.</td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629-10G</td><td>יש להיזהר בעת הטיפול, רעיל.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BDH Chemicals</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>PBS (pH 7.4)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי (100 מ"מ x 20 מ"מ)</td><td>קורנינג בע"מ.</td><td></td><td></td>430167</tr><tr><td>Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 מ"מ 250 מ"מ x 4.6 מ"מ עמודה</td><td>Phenomenex</td><td>00G-4439-E0</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo אדום Escherichia coli BioParticles מצומדים</td><td>Thermo Scientific</td><td>P35361</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>P35361</td><td>שמור על -20 מעלות; C ולהגן מפני אור. הכינו תמיסת מלאי של 1 מ"ג/מ"ל על ידי המסת 2 מ"ג מוצר ליופילי ב-2 מ"ל של PBS בתוספת 20 מ"מ HEPES, pH 7.4.</td></tr><tr><td>פיפטת העברת פלסטיק</td><td>Medi'Ray</td><td>RL200C</td><td></td></tr><tr><td>פולוקסמר 188</td><td>BASF מזרק לחץ תאגיד</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Applied Scientific Instruments</td><td>MPPI-2</td><td></td></tr><tr><td>מאייד סיבובי</td><td>B&uuml; chi, Flawil, שוויץ</td><td>B&uuml; chi R-215 Rotavapor</td><td></td></tr><tr><td>סריקת מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>אולימפוס</td><td>אולימפוס FV1000 FluoView</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall WX+ אולטרה-צנטריפוגה</td><td>Thermo Scientific</td><td>75000090</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>MZ12</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>הכינו תמיסת מלאי של 4 מ"ג/מ"ל (ב-H2O נטול יונים) ושמרו על -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>triton-X100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>אמבט אולטרסאונד</td><td>Thermo Scientific</td><td>FB-11205</td><td></td></tr><tr><td>Volocity תוכנת ניתוח תמונה</td><td>PerkinElmer</td><td>גרסה 6.3</td><td></td></tr><tr><td>אמבט</td><td></td><td></td><td></td>מים</tr><tr><td>Zetasizer Nano</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>Zetasizer Nano ZS ZEN 3600</td><td></td></tr></tbody></table>

הכוונת תרופות לזחל מקרופאגים על ידי הזרקת סמים טעונים ליפוזומים

Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes

Zebrafish (danio rerio) הזחלים התפתחו למודל פופולרי לחקור אינטראקציות מארח הפתוגן והתרומה של תאים חיסוניים מולדים למחלות דלקתיות בשל המערכת החיסונית שלהם שימור פונקציונלית מולדים. הם גם משמשים רבות כדי לבחון כיצד תאים חיסוניים מולדים לסייע להדריך תהליכים התפתחותיים. על-ידי ניצול השקיפות האופטית ואת השיטות הגנטיות של זחל צברפיש, מחקרים אלה מתמקדים לעתים קרובות על גישות הדמיה חיה לאפיין פונקציונלי מסומנים פלואורוסקופים ונויטרופילים בתוך בעלי חיים שלמים. בשל טרוגניות תפקודית מגוונת שלהם והרחבת תפקידים בפתוגנזה המחלה, מקרופאגים קיבלו תשומת לב משמעותית. בנוסף למניפולציות גנטיות, התערבויות כימיות משמשות כעת באופן שגרתי כדי לתמרן ולבחון התנהגות מקרופאג בזחל מדגים. מסירת תרופות אלה מוגבלת בדרך כלל למיקוד פסיבי של תרופה חופשית באמצעות טבילה ישירה או מיקרוהזרקה. גישות אלה מסתמכות על ההנחה כי כל שינוי התנהגות מקרופאג הם תוצאה של השפעה ישירה של הסם על מקרופאגים עצמם, ולא תוצאה במורד הזרם של השפעה ישירה על סוג תא אחר. כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים שלנו במטרה לכוון תרופות במיוחד לזחל מקרופאגים באמצעות מיקרוהזרקת סמים שנטענו ליפוזומים. אנו חושפים כי poloxamer 188-שונה ליפוזומים לתרופות פלורסנט כחול הם נלקח בקלות על ידי מקרופאגים, ולא על ידי נויטרופילים. כמו כן, אנו מספקים ראיות לכך שסמים הנמסרים בדרך זו יכולים להשפיע על מקרופאג פעילות באופן עקבי עם מנגנון פעולת התרופה. טכניקה זו יהיה ערך לחוקרים המבקשים להבטיח המיקוד של תרופות מקרופאגים וכאשר הסמים רעילים מדי כדי להיגאל על ידי שיטות מסורתיות כמו טבילה.

הגישה של הסרט הדק המתואר כאן להכנת ליפוזומים פלורסנט התרופה התוחמת היא שיטה פשוטה וחסכונית. עם הפרוטוקול המשמש במחקר זה, היפוזומים צפויים להיות unilamellar23,24. הגודל, פוטנציאל זטה, העמסה של סמים ויעילות מלכודת של ליפוזומים המיוצרים מסוכמים בטבלה 1. גודל החלקיקים של הליזומים (לפני ואחרי העמסת הסמים) דומים (טבלה 1). מטען השטח (הפוטנציאל זיטה) של סמים טעונים ליפוזומים הוא מעט נייטרלי יותר לעומת ליפוזומים שליטה, עם זאת, הם כולם טעו...

כאן, אנו מתארים את הסינתזה של ליפוזומים בסמים שנטענו וההזרקה שלהם לזחל הדגים מטרה למטרה לכוון מסירת סמים לתאי השושלת מקרופאג.

Zebrafish (Danio rerio) larvae have developed into a popular model to investigate host-pathogen interactions and the contribution of innate immune cells ...

פרוטוקול זה מתאר טכניקה לפילוח תרופות מעניינות כדי לזחל מקרופאגים זברה כדי לתפעל ולהעריך פונקציית מקרופאג. טכניקה זו יש יתרונות על פני אסטרטגיות משלוח תרופות מסורתיות כגון טבילה על ידי הבטחת כי התרופות ממוקדות במיוחד מקרופאגים באמצעות אנקפסולציה liposome. כאשר מוחל על מודלים זברה של מחלה עם מרכיב דלקתי, טכניקה זו יש פוטנציאל לפתור כיצד מקרופאגים לתרום תהליכים פתולוגיים.כאן, אנו מדגימים את התועלת של טכניקה זו על ידי מיקוד תרופה מעכבת מיני חמצן מיטוכונדריאלי-תגובתי מקרופאגים כדי לדכא את ההפעלה. microinjection של ליפוזומים טעון סמים לתוך הזחלים יכול להיות מאתגר, כמו טיפול יש לנקוט כדי לא לגרום נזק אפיתל מוגזם, פוטנציאל להשפיע על מחקרים אימונולוגיים. הדגמה חזותית של פרוטוקול זה חשובה משום שהיא כרוכה במתודולוגיות תאים חיים פרמקולוגיים ובעלי חיים שלמים שלא ניתן לבצע באופן שגרתי במעבדה אחת.כדי להכין 10 מיליגרם של ליפוזומים בבקבוק 25 מיליליטר עגול תחתון, להוסיף 31 nanomolars של כחול ימי 300 nanomolars של מיטוכונדריאלי תגובתי מינים מעכבי זן לבקבוק. Sonicate לזמן קצר כדי להתמוסס באופן מלא, ולהסיר את הממס לאט על אידוי סיבובי להגדיר מעל אמבט מים 45 מעלות צלזיוס ב 75 סיבובים לדקה תחת לחץ ואקום. כאשר סרט דק שומנים יבש נוצר בתוך קירות הזכוכית של הבקבוק, עוד יותר לייבש את הסרט במשך 45 דקות תחת חנקן כדי להקל על הסרה מלאה של הממס האורגני.לאחר מכן, לחות את הסרט עם מיליליטר אחד של PBS, ולאטום את הבקבוק עם סרט פרפין לפני תסיסה את הבקבוק ביד על 60 מעלות צלזיוס אמבט מים במשך 20 דקות. לאחר שבעה מחזורים של הקפאה והפשרה, השתמשו במיני-אקסטרודר ובמיקרומטר אחד של קרום פוליקרבונט חרוט כדי להחדיר את השומומים במשך שניים עד שישה מחזורים. כאשר וריקלים unilamellar גדולים הושגו, לדחוס את ליפוזומים טריים לתוך גלולה על ידי אולטרה צנטריפוגה.הדגירה את גלולה עם מיליליטר אחד של 1%poloxamer 188 פתרון במשך 30 דקות ב 45 מעלות צלזיוס ו 750 סיבובים לדקה ב ThermoMixer עם חיבור צינור מיקרוצנטריפוגה שני מיליליטר. במהלך החדרת פוסט poloxamer 188 לתוך ליפוזומים, ריכוז poloxamer הנכון, זמן הדגירה, והטמפרטורה חשובים להשגת המאפיינים הפיזיוכימיים האופטימליים של ליפוזומים וכתוצאה מכך. בסוף הדגירה, ultracentrifuge את התערובת שוב באותם תנאי צנטריפוגה, ולהסיר את supernatant המכיל כל פולימר או תרופה לא מאוגדת.לאחר מכן לאחסן את כדורי ליפוזום בארבע מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור. כדי לקבוע את הגודל ואת הפוטנציאל זטה של ליפוזומים, לדלל את ניסוח ליפוזום עם מים אולטרה-100 ביחס של אחד ל -100. השתמש במנתח פיזור אור דינמי כדי למדוד את גודל החלקיק, מדד הפולידיספרסיות ופוטנציאל הזטה ב-25 מעלות צלזיוס.כדי לחשב את יעילות המלכודת ואת טעינת הסמים של ליפוזומים, להמיס את ליפוזומים טריטון X-100. הזרק 20 מיקרוליטרים של דגימת ליפוזום מומסת למערכת כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה עם משאבה quaternary, גלאי מערך דיודה להגדיר ב 230 ננומטר, וטור שלושה מיקרומטר, 250 פעמים-4.6 מילימטר. כדי להכין זחלי זברה מהונדסים להזרקה, השתמש במטסים עדינים כדי לפענח ידנית 30 שעות לאחר ההפריה, ולאפשר לעוברים להתפתח ב-28.5 מעלות צלזיוס עד יומיים לאחר ההפריה.כאשר העוברים הגיעו לשלב המתאים, מדללים ניסוח ליפוזום טרי ביחס של אחד לאחד ב- PBS סטרילי, ומערבבים את הפתרון במשך שתיים עד שלוש שניות על ידי מערבולת. יוצקים מספיק תאית מתיל 3% במדיום E3 לתוך המכסה של מכסה צלחת קטן, 35 מילימטר תרבות כדי ליצור סרט דק מכסה את פני השטח כולו. השתמש פיפטה העברת פלסטיק כדי לאסוף בריכה של כ 20 עד 25 זחלים הרדמה.אפשר לעוברים להתרכז בקצה הפיפסה בכוח הכבידה, ולהעביר בזהירות את הזחלים לאמצע מכסה צלחת התרבות 35 מ"מ עם פתרון מינימלי. השתמש מטעין microcapillary כדי לסדר את הזחלים עם הקדמיים שלהם לכיוון החלק העליון של צלחת ההזרקה עם משטח הגב פונה לכיוון מחט microinjection להזרקה לתוך החדר hindbrain או עם הקדמיים שלהם לכיוון החלק השמאלי של צלחת ההזרקה עם משטחי הגחון פונה לכיוון מחט microinjection להזרקה לתוך ונוסוס סינוס. השתמש מטעין microcapillary כדי למלא בחזרה מחט הזרקה עם כחמישה microliters של תערובת הזרקת ליפוזום.הר את המחט לתוך מיקרומניפולטור המחובר לעמדה מגנטית ומזרק לחץ, והצב את ההתקנה תחת מיקרוסקופ סטריאו. השתמש נקי, ממטרים קצה דק לחתוך את קצה המחט microinjection כדי ליצור פתח של כחמישה מיקרומטר קוטר. הגדר את המזרק למשך פולס של כ 50 אלפיות שנייה ולחץ הזרקה של כ 40 פאונד לאינץ 'מרובע.להזריק בולוס לתוך טיפה של שמן מינרלי ממוקם מעל קווי הרשת של hemocytometer כדי לכייל את הנפח להיות מוזרק. לאחר מכן להתאים את משך הדופק ו / או את לחץ ההזרקה עד קוטר הבולוס מכסה 2 1/2 של קווי הרשת הקטנים ביותר. בזהירות להזריק nanoliter אחד של תערובת הזרקת ליפוזום לתוך החדר האחורי של כל זחלים.מיד לאחר הזריקות, מוסיפים מדיום E3 לצלחת ההזרקה, ולהשתמש פיפטה העברת פלסטיק בעדינות להתסיס את הזחלים מתוך תאית מתיל. כדי לדמיין את המשטח הגבי של ההידברות על מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בעדשת טבילה במים, מלא תחילה צלחת תרבות של 35 מ"מ לעומק של חמישה מילימטרים עם מדיום הרכבה, ותן למדיום לפולימר. חפר תעלה קטנה באזרוז של שטח מספיק כדי להכיל את שקי החלמון של העובר הניסיוני, ולהשתמש פיפטה העברת פלסטיק מלא מדיום הרכבה מותכת כדי לאסוף זחל הרדמה.מיד להפקיד את הזחל לתוך צלחת התרבות, ולהשתמש מטעין microcapillary כדי לכוון את צד הגחון חלמון למטה לתוך החורים שנחפרו. שמור על העובר בתמורת זו עד שהתעוררות פולמריזציה. כיסוי העובר עם E3 בינוני בתוספת 200 מיקרוגרם למיליליטר של tricaine.כדי לחיות בתמונה בחדר hindbrain, בחר את המטרה 20x והגדר את המיקרוסקופ הקונפוקלי ל- 512 על 512 פיקסלים וזום של פי 2.5. כאשר הפרמטרים מיקרוסקופ נקבעו, לרכוש 40 על ידי שלושה מיקרומטר Z-ערימות המשתרעים מן פני השטח הגבי ביותר של hindbrain באמצעות הדמיה דו-ערוצית כדי תמונה ליפוזומים פלואורסצנטי כחול מקרופאגים פלואורסצנטיים ירוקים. כאשר כל התמונות הושגו, לטעון את הקבצים לתוך תוכנה מתאימה לניתוח תמונה 3D.תחת הכרטיסיה מדידה, גרור את הפרוטוקול חיפוש אובייקטים לשטח גרירת משימות כאן כדי לבצע מדידות. בחרו בערוץ DAPI כדי לסמן את הליפוזומים, וגררו את הכלי בדיקה דרך מקטעי Z כדי לזהות את המקרופאגים עמוסי הליפוזום. לכימות עוצמת הפלואורסצנטיות של ליפוזומים בתאים הבודדים, גררו את הפרוטוקול 'גזור לאזורים מעניינים' למרחב 'גרור משימות כאן כדי לבצע מדידות', ולהשתמש בכלי מלבן כדי לצייר תיבה מסביב לתא המעניין בממדי X, Y ו- Z.לאחר מכן בחרו 'צור פריט מדידה' מהתפריט הנפתח 'מדידות' ליצירת קובץ מדידה בחלון הספרייה. בטבלה זו, גודל, פוטנציאל זטה, טעינת סמים, ויעילות מלכודת של ליפוזומים המיוצרים מסוכמים. כפי שנצפה, גודל החלקיק של ליפוזומים דומה עם ובלי טעינת סמים, אם כי מטען פני השטח של ליפוזומים טעונים בסמים הוא קצת יותר ניטרלי מאשר ליפוזומים שליטה עם כחול ימי בלבד.Microinjection של ליפוזומים בעלי תווית כחולה ימית לתוך החדר האחורי, כפי שהוכח, תוצאות ספיגה מהירה על ידי מקרופאגים תושב כי ניתן לכמת בקלות על ידי מיקרוסקופיה confocal על ידי שלוש שעות לאחר ההזרקה. נויטרופילים, לעומת זאת, הם נצפו לעתים רחוקות להכיל ליפוזומים תאיים. בתוך מקרופאגים עמוסי ליפוזום בודדים, ליפוזומים מצטברים בתוך התאים הפלגוליזומליים, אשר הכרחי עבור השפלה ליפוזום ושחרור תוכן התרופה הבאים לתוך הציטופלסמה.משלוח לתוך venosus סינוס יכול לספק את הליפוזומים כדי caudal hematopoietic רקמה תושב מקרופאגים דרך זרימת הדם. Microinjection של ליפוזומים טעון עם התרופה מעכבת מינים חמצן מיטוכונדריאלי-תגובתי לתוך החדר האחורי יכול לדכא באופן משמעותי מונוסודיום urate קריסטל מונחה מיטוכונדריה תגובתי מינים של מינים חמצן בתוך מקרופאגים עמוסי ליפוזום hindbrain תושב. אימות נוסף של ההשפעות המדכאות של תרופות מעניינות על מצבי הפעלת מקרופאג יכול להתבצע על ידי חקירת ביטוי גנים ציטוקינים proinflammatory על ידי הר שלם בהכלאה situ ואת הגיוס הזמני של נויטרופילים.באמצעות טכניקה זו, הצלחנו למקד תרופות מקרופאגים כדי לאשר כי מנגנון immunometabolic מניע את הפעלתם במודל זברה זחל של דלקת דביקה חריפה. הסתגלויות עתידיות של פרוטוקול זה יכולות לכלול ביצוע שינוי פני השטח של ליפוזום כדי לשפר את מיקוד מקרופאג ' או כדי לקדם פילוח לתאי חיסון אחרים, כגון נויטרופילים.

targeting-drugs-to-larval-zebrafish-macrophages-injecting-drug-loaded

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

עוברי דג הזברה שקוף הוכיחו המארחים מודל שימושי כדי לחזות אינטראקציות למידה תפקודית בין תאים חיסוניים מולדים פתוגנים חיידקיים תאיים,...

זיהום של עוברים דג הזברה עם פתוגנים חיידקיים תאיים

ההתפתחות המהירה, גודל קטן השקיפות של דג הזברה הם יתרונות עצומים למחקר שליטה החיסון המולדת של...

הדמיה לא פולשנית של פטרת מופצת הזחלים דג הזברה

המאמר מתאר אבלציה ממוקדת בכבד, שיטה לגרימת מוות של הפטוציטים עם מטרונידזול בזחלי דגי זברה טרנסגניים. פרוטוקול הדגימה מתאר את התהליך ליצירה, מניפולציה והערכה של אבלציה ממוקדת בכבד בדגי זברה.

אבלציה ממוקדת בכבד: גרימת מוות של הפטוציטים עם מטרונידזול בזחלי דגי זברה טרנסגניים

הסרטון מדגים טכניקת פציעה ולכידה של דגי זברה לצפייה בזיהום פתוגן פטרייתי המסומן באופן פלואורסצנטי בזחלי דגי זברה. זיהום ראשוני מושך מקרופאגים, וככל שהזיהום נמשך, גיוס נויטרופילים מתקדם באתר ההזרקה.

טכניקת zWEDGI להמחשת זחלי זברה נגועים בפתוגן פטרייתי

הסרטון מדגים מיקרו-הזרקה של ליפופוליסכרידים (LPS) למוחם של זחלי דגי זברה כדי לגרום לדלקת עצבית. הזחלים ממוקמים על צלחת מרופדת באגרוז, המחט מוחדרת לחדרי המוח, וה-LPS מוזרק. ה-LPS המוזרק מעורר תגובה חיסונית שמובילה לדלקת עצבית.

גרימת דלקת עצבית בזחלי דגי זברה עם הזרקת ליפופוליסכריד

עוברי דג זברה שקופים אופטית נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקור ולדמיין בזמן אמת את האינטראקציות בין מיקרואורגניזמים פתוגניים לתאי החיסון המולדים. מיקרו-הזרקה של Mycobacterium abscessus, בשילוב עם הדמיה פלואורסצנטית, משמשת לבחינת מאפיינים פתוגניים חיוניים כגון היווצרות חבל בעוברי דג זברה.

פענוח ופתוגנזה הדמיה והשתרגות<em&gt; Abscessus Mycobacterium</em&gt; בעוברי דג הזברה

Microinjection של דג זברה עוברי וזחלים היא טכניקה חיונית ומאתגרת המשמשים דגמים רבים של דג זברה. כאן, אנו מציגים מגוון רחב של כלים microscale כדי לסייע ייצוב והכיוון של דג זברה הן microinjection והן הדמיה.

Microstructured מכשירי Microinjection אופטימיזציה והדימות של הזחלים דג זברה

כדי לבדוק את ההשפעה של כימוקין על גיוס מקרופאג ב vivo, את כל הר היברידיזציה באתרו שימש כדי לזהות את הביטוי החוץ רחמי של כימוקין, וכתמים חיסוני שימש תוויות מקרופאגים. הדמיה חיה שימש התבוננות בזמן אמת של הגירה מקרופאג.

כימוקין חוץ רחמי ביטוי מודל לבדיקת גיוס מקרופאג ב Vivo

פרוטוקול זה מתאר טכניקה להמחיש התנהגות מקרופאג ומוות העובריים מתחלקים במהלך הזיהום של מריחיידק של פטרת . צעדים להכנת חיידקים, זיהום העוברים, ומיקרוסקופ ה, כלולים. טכניקה זו עשויה להיות מיושמת על התבוננות של התנהגות תאית ומוות בתרחישים דומים הכרוכים זיהום או דלקת סטרילית.

ויזואליזציה של מקרופאג Lytic תא המוות במהלך זיהום פטרת העוברים באמצעות מיקרוסקופ אינטרטל

Zebrafish מודלים מבע לאפשר סינון תפוקה גבוהה ההקרנה והדמיה פלורסנט של תאים סרטניים אנושיים ב vivo microenvironment. פיתחנו זרימת עבודה עבור קנה מידה גדול, הקרנת תרופות אוטומטיות על החולה הנגזרת דגימות לוקמיה ב דג זברה באמצעות מיקרוסקופ אוטומטי מצויד במיקרוסקופ הדמיה יחידה.

הקרנת התרופה של החולה העיקרי הנגזר גידול Xenografts ב Zebrafish

פרוטוקול זה מדגים את המיקרו-הזרקה של ליפופוליסכריד לאזור חדר המוח במודל של זחל דג זברה כדי לחקור את התגובה הנוירו-דלקתית והרעילות העצבית המתקבלות כתוצאה מכך.

מיקרו-הזרקות חדריות למוח של ליפופוליסכריד לדגי זברה זחליים להערכת דלקת עצבית ורעילות עצבית

למדו שיטה להכוונת תרופות למקרופאגים בזחלי דגי זברה באמצעות הזרקת ליפוזומים טעונים. טכניקה זו מאפשרת לחקור תפקוד מקרופאגים במחלות דלקתיות ולהבין את תרומתם לתהליכים פתולוגיים בביולוגיה התפתחותית.

הכוונת תרופות לזחל מקרופאגים על ידי הזרקת סמים טעונים ליפוזומים

גלה סרטונים נוספים