Name: אוסף של אזורים קפואים המוח מכרסם עבור ניתוח במורד הזרם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: למדו איסוף אזורי מוח קפואים מעכברי CD-1 לקבלת חלבון ו-RNA באיכות גבוהה. שיטה זו שומרת על שלמות המולקולות ומאפשרת ניתוח מורכב במורד הזרם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכת על ידי ה-NIH, DA043982 ו-DA046196.

בעלי חיים המשמשים במחקר זה טופלו בצורה אתית והומאני כפי שנקבעו על ידי בעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת אינדיאנה והשתמש הוועדה (IACUC) והמכון הלאומי לבריאות (NIH) הנחיות.
הערה: כל הכלים והמשטחים צריך להיות שטף עם הממס המתאים כדי להסיר נוקלאוסים18 לפני תחילת כל עבודה.
1. אחסון מוחות
<ol><li>במהירות להסיר את המוחות מCD1 מורדמים עכברים מסוג wildtype במשקל כ 30 g באמצעות גישה קונבנציונלית13 ו-flash הקפאה עבור 60 שניות בחנקן נוזלי או איזופנטאן pre-מקורר עם קרח יבש.</li>
	<li>אחסן מוחות קפואים ב-80 ° צ' ברדיד אלומיניום או בצינורות חרוטיים עד השימוש.</li>
</ol>2. הכנת מטריצת המוח
<ol><li>עשרים וארבע שעות לפני שהוא מבתר את הרקמה, מניחים מטריצת מוח נקיה (ראו לוח חומרים) על ערימת חבילות הקפאה מופשרים. כריך את הצדדים של המטריצה בין שתי חבילות המקפיא מוודאים לעזוב כ 0.5 ס מ בין החלק התחתון של חריצי תער לבין החלק העליון של חבילות ג'ל (איור 1A). מניחים רדיד אלומיניום על הקצוות כדי לסייע בקירור. הערה: בעת רכישת מטריצת מוח, קנה אחת שהיא גדולה מספיק כדי לאפשר במקרה את נפח המוח כולו כדי לגזור.</li>
	<li>מניחים את התיבה המכילה את מטריצת המוח ואת חבילות ההקפאה במקפיא של 20 ° c עם הטופ אג'ר בן לילה.</li>
</ol>3. הגדרת צלחת זכוכית קפואה
הערה: מטרת ההתקנה היא להכין משטח קפוא שעליו לנתח את חתכי המוח.
<ol><li>מניחים קרח בקופסה מבודדת עד כ 5 ס מ מלמעלה. ואז מניחים שכבה 2.5 ס מ של קרח יבש על גבי הקרח וכיסוי עם יריעות פלסטיק שחור כדי לסייע בהמחיש את המדגם (איור 1B, איור 1b).</li>
	<li>מניחים צלחת זכוכית (צריך רק להתאים את הפתיחה של התיבה) על גבי פלסטיק ומניחים קרח יבש על גבי הצלחת בפינות הרחוק (איור 1C).</li>
	<li>לקחת את מטריצת המוח קפוא מהמקפיא ולהכניס את המוח כדי לחתוך את הקליפה בצד. אפשר לו לשנות את הטמפרטורה בתיבה במשך 10 דקות. שמור את המכסה על התיבה בזמן זה.</li>
	<li>כוונן את מיקומו של המוח במטריצה עם מלקחיים קרים כך שסינוס המשונן והסינוס הרוחבי יהיו בשורה עם החריצים הניצבים בגוש הבלוק (איור 1D). פעולה זו תסייע להבטיח מקטעים סימטריים עבור ניתוח קל יותר. לגעת קצות מלקחיים לקרח יבש לזמן קצר לפני התאמת המוח.</li>
	<li>לאחר המוח נמצא בעמדה, המקום להב תער מקורר ליד המרכז שלו ולחץ על הלהב כ 1 מ"מ לתוך הרקמה. הוסף להבים מקורר לקצוות rostral ו caudal כדי לעזור להחזיק את המוח במקום (איור 2A ואיור 2a).</li>
	<li>החל מהקצה הrostral, הוסף להבים אחד בכל פעם, הצבת אותם לתוך החריצים והקשה עליהם בעדינות למטה לתוך הרקמה כ 1 מ"מ (איור 2B). המשך להוסיף להבים במרווחי זמן של 1 מ"מ העובדים לקראת סוף caudal.</li>
	<li>תוודא שהמוח לא משתנה. בזמן הזה בשורה להבים אופקית ואנכית (איור 2B). כדי לגזור סעיפים לרוחב 0.5 מ"מ, פרופיל נמוך להבי מיקרוטומה (ראה טבלת חומרים) ניתן להשתמש. הניחו אותם בין סכיני גילוח גדולים יותר (איור 2 ג).</li>
	<li>ברגע שלהבים נמצאים במקומם, לחץ על החלק העליון של הקבוצה עם האצבעות, כף היד או משטח שטוח אחר (איור 2C, איור 2c). רוק את קבוצת להבים לאט מצד לצד כדי להעביר אותם דרך הרקמה. הערה: הדבר עשוי להימשך זמן מה (1 – 2 דקות) ודורש סבלנות. צריכה להיות התנגדות ללהבים. שזזות דרך הרקמה כניסה קלה פירושה המוח הוא הפשרה ואת הבלוק צריך להיות מקורר עם קרח יבש.</li>
	<li>כאשר כל הלהבים הגיעו לתחתית החריצים, אחוז בכל צד של קבוצת הלהבים והעבודה החופשית של המטריצה על ידי הנדנדה הלוך ושוב. הערה: תרגיל זהירות כדי להימנע מגזירת עצמך על הקצוות החדים של הלהבים.</li>
	<li>לאחר הקבוצה היא חופשית, למקם את הערימה, rostral בצד למעלה, על צלחת הזכוכית (איור 2E). הניחו קרח יבש לצד ו/או על גבי המחסנית כדי להקפיא עוד יותר את הדגימות לצורך הפרדה קלה יותר.</li>
	<li>מניחים את המחסנית עם קצוות חדים על צלחת הזכוכית ועל להבים נפרדים על ידי העברת המחסנית בין האגודלים והאצבעות. הלהבים צריכים להיפרד זה מזה עם מקטעים מחוברים.</li>
	<li>השורה סעיפים על צלחת זכוכית מ rostral כדי caudal (איור 2F).</li>
	<li>רקמה נפרדת מהלהבים על ידי להבים מכבישה בין אצבעות, או על ידי הפרדה עם תער קר שני (דמויות 2G, 2G, 2G).</li>
</ol>4. חתכי ניתוח
<ol><li>פתח את המוח אלן עכבר אטלס או הפניה אחרת ולמצוא ציוני דרך הנחוצים כדי לזהות אזורים של עניין. כמה מהאתרים הבולטים כוללים את המנה הקדמית של המזנון, את מספר החדרים לרוחב, ואת ההיפוקמפוס (איור 3).</li>
	<li>הפוך את המקטע לגזור עם מלקחיים מקורר ולוודא שהאזור שעומד לאסוף הוא עקבי לאורך כל הקטע. במהלך הקציר, להתייעץ אטלס התייחסות לעתים קרובות כדי לוודא את ההחזר הנכון מושגת. הערה: זכוכית מגדלת או מיקרוסקופ מבתר מועילים לעתים קרובות בתהליך זה. גם תאורה טובה הכרחית. מנורות LED בהספק נמוך או מנורה קרירה (ראה טבלת חומרים) יכולה לשמש למטרה זו.</li>
	<li>עם אזמל נקי או פונץ ', חותכים לתוך המקטע (איור 4). Prechill כל כלי לפני חיתוך על ידי נגיעה בו לזמן קצר כדי קרח יבש. דחפו את הלהב בעדינות אך בחוזקה לתוך הרקמה, מטלטל אותו הלוך ושוב כדי לבצע את החיתוך. אל תדחפי חזק מדי או שרקמת העור תהיה בסדר. הערה: כלים יתחממו לאורך זמן. להבי מחומם מעט יכול להועיל בעשיית חתכים נקיים והוא יכול להגביל שבירה, אבל להיות זהירים כדי למנוע היפיית הרקמה. מדי פעם מקררים כלים על קרח יבש.</li>
	<li>לאחר ההחזר הוא נקצרו, מניחים אותו לתוך תווית, מקורר 1.5 mL צינורות. אחסן רקמות שנקטפו ב-80 ° צ' עד הצורך.</li>
	<li>לעבד רקמה קפואה שנאסף באופן זה על ידי הוספת מאגר ריפה קר (50 mM טריס, pH 8.0, 150 מ"מ הנאל, 1% טריטון X-100, 0.1% SDS, 0.5% ברנשים ומעכבי החלבון קוקטייל (ראה טבלת חומרים)) עבור חילוץ חלבונים, או guanidinium-מכיל ממיס (ראה טבלת חומרים) להפקת RNA למדגם קפוא המהגון מיידית באמצעות dounce זכוכית או הומוגנגניצר מכני (ראה לוח חומרים). בדרך זו, מעכבי פרוטאז ו נוקלאז הם במקום כמו המדגם מחמם כדי להגן על חומצות חלבון וגרעין מפני השפלה.</li>
</ol>

<ol><li>Allen Institute. Allen Mouse Brain Atlas. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://mouse.brain map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas">https://mouse.brain map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas</a> (2008).</li>
<li>Kuleshova, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+-+New+Potentials+for+Electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Optogenetics - New Potentials for Electrophysiology.</a> Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).</li>
<li>Scanziani, M., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+in+the+age+of+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461, 930(2009).</li>
<li>Shimono, M., Beggs, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Clusters%2C+Hubs%2C+and+Communities+in+the+Cortical+Microconnectome%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+cortex%22%5BJournal%5D)">Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome.</a> Cerebral cortex. 25 (10), New York, N.Y. 3743-3757 (2015).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Kebschull, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+mapping+of+single+neuron+projections+by+sequencing+of+barcoded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA.</a> bioRxiv. , 054312(2016).</li>
<li>Mitulović, G., Mechtler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPLC+techniques+for+proteomics+analysis%E2%80%94a+short+overview+of+latest+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">HPLC techniques for proteomics analysis—a short overview of latest developments.</a> Briefings in Functional Genomics. 5 (4), 249-260 (2006).</li>
<li>Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+DNA+and+RNA+isolation+from+brain+punches+for+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics.</a> BMC Research Notes. 4, 314(2011).</li>
<li>Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-dissection+of+Rat+Brain+for+RNA+or+Protein+Extraction+from+Specific+Brain+Region%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region.</a> JoVE. (7), e269(2007).</li>
<li>Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAring%2C+L+%22Laser+Capture+Microdissection.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology</a>. Murran, G. 1723, Humana Press. 2457(2018).</li>
<li>Björk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione-S-transferase+expression+in+the+brain%3A+possible+role+in+ethanol+preference+and+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity.</a> The FASEB Journal. 20 (11), 1826-1835 (2006).</li>
<li>Jeong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Network+Dysregulation+in+the+Trigeminal+Ganglia+and+Nucleus+Accumbens+of+a+Model+of+Chronic+Migraine-Associated+Hyperalgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Systems+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 12 (63), (2018).</li>
<li>Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpijker%2C+S+%22Neuroproteomics%2C+Neuromethods%22">Neuroproteomics, Neuromethods</a>. Li, K. W. 57, Humana Press. 13-26 (2011).</li>
<li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+removal+of+hypothalamic+or+other+brain+nuclei+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat.</a> Brain Research. 59, 449-450 (1973).</li>
<li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalkovits%2C+M+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 103, Academic Press. 368-376 (1983).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates.+2+edn%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn</a>. , Academic Press. (2001).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates.+4+edn%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn</a>. , Academic Press. (1998).</li>
<li>RNaseZap. Ambion. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/ manuals/cms_056889.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/ manuals/cms_056889.pdf</a> (2008).</li>
<li>Mueller, O. L., Samar,, Schroeder,, Andreas, RNA Integrity Number (RIN)- Standardization of RNA Quality Control. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/ applications/5989-1165EN.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/ applications/5989-1165EN.pdf</a> (2016).</li>
<li>Scheyer, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoid+Exposure+via+Lactation+in+Rats+Disrupts+Perinatal+Programming+of+the+Gamma-Aminobutyric+Acid+Trajectory+and+Select+Early-Life+Behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Cannabinoid Exposure via Lactation in Rats Disrupts Perinatal Programming of the Gamma-Aminobutyric Acid Trajectory and Select Early-Life Behaviors.</a> Biological Psychiatry. , (2019).</li>
<li>Choi, D. W., Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+glutamate+neurotoxicity+in+hypoxic-ischemic+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death.</a> Annual Review of Neuroscience. 13 (1), 171-182 (1990).</li>
<li>Guhaniyogi, J., Brewer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+stability+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA stability in mammalian cells.</a> Gene. 265 (1-2), 11-23 (2001).</li>
<li>Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+RNA+degradation+for+estimation+of+post+mortem+%5Bcorrected%5D+interval%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval.</a> PloS One. 8 (2), 56507(2013).</li>
<li>Yamagata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signs+of+biological+activities+of+28%2C000-year-old+mammoth+nuclei+in+mouse+oocytes+visualized+by+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4050(2019).</li>
<li>Ambion. RNAlater® Tissue Collection: RNA Stabilization Solution. ThermoFisher Sci. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_056069.pdf">http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_056069.pdf</a> (2011).</li>
<li>Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas">https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas</a> (2008).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

עבודה זו מתארת טכניקה לבודד אזורים קטנים וספציפיים של המוח תוך הגבלת השפלה של חומצת גרעין וחלבונים. נזק לרקמות המוח קורה. במהירות ברגע שאורגניזם מת זה באופן חלקי בשל הצטברות מהירה של גלוטמט החילוץ ואת ההתרגשות הנובעת שמתרחשת21. שליח RNA פגיע במיוחד להשפלה22,23. פירוט של חומצות חלבון וגרעין מופחת מאוד בטמפרטורות נמוכות כפי שמעידים על ידי המאמר האחרון המתאר פעילות ביולוגית בתאים ממותה קפוא בתוך קפואה 28,000 שנים לפני24</sup...

עבודה זו ממחישה את הניתוח של אזורי המוח קפוא להפקת חומצה גרעין באיכות גבוהה או חלבון באמצעות התייחסות, כגון המוח העכבר אלן אטלס1, כמדריך. בטכניקה זו, המוחות מוקפאים ומאוחסנים ב-80 ° c לצורך הצבה מאוחרת יותר ולאחר החיתוך תוך כדי תחזוקה במצב קפוא. תהליך זה מאפשר לחוקר לקצור מספר רב של מוחות בפגישה אחת ולאחר מכן לנתח אותם לאוסף מדויק של אזורי מוח מרובים.
האוסף המדויק של אזורי המוח המעניינים (ROIs) נדרש לעתים קרובות כאשר מענות על שאלות הקשורות לביטוי הגן והחלבון. בעוד פרמקולוגיה, אלקטרופיזיולוגיה ו אלקטרואופטיקה ניתן להשתמש על סוג wildtype מכרסמים מהונדסים גנטית כדי לעזור להבהיר שינויים מולקולריים הצמדת התנהגויות שנצפו2,3,4, המדידה של שינויים המושרה ב transcript ו פרוטמס משמש לעתים קרובות כדי לתמוך בממצאים אלה. טכניקות כגון שעתוק הפוכה כמותית תגובת שרשרת פולימראז (RT-qPCR), בלוק מערבי, RNAseq5, mapseq6 ו כדיקות7 הם חזקים יחסית נמוך בעלות, המאפשר מעבדות רבות ללמוד שינויים מולקולריים המושרה בתוך מחוזות המוח הקטן2,4,5,6.
ישנן מספר דרכים כדי לחלץ ולטהר חומצות גרעין או חלבון מאזורי המוח8,9,10,11,12. מעבדות רבות הקציר אזורי המוח על ידי מצמרר וחיתוך המוח על הקרח בזמן הקציר9,13. בעוד גישה זו יכולה לגרום חומצה גרעין באיכות גבוהה וחלבון, זה קצת זמן מוגבל כמו השפלה בתוך מיקרוסביבה של הרקמה עשויה להתרחש בטמפרטורות אלה. זה יכול להיות נכון במיוחד כאשר מנסים לנתח מספר גדול של בעלי חיים או ROIs בישיבה אחת. שמירה על דגימות קפוא מסייע לשמור יציב משך מולקולות היעד תוך מתן זמן החוקר להשוות בקפידה ציוני דרך משני הצדדים של כל קטע במאמץ לאסוף דגימות טהור יחסית. לכידת לייזר היא דרך נוספת לאסוף רקמות עבור RNA או ניתוח חלבון מאזורי המוח10. הליך זה הוא מעולה לניתוח מכני באותו ROIs קטן מאוד בצורה לא סדירה ניתן לזהות ולבודד. עם זאת, לכידת לייזר מוגבל על ידי שימוש של ציוד יקר ריאגנטים, הוא זמן רב ועלול גם להיות פגיע יותר לירידה במדגם.
ניתוח micropunch ' על רקמות קפואות הוא לא חדש. מאמרים מוקדמים של מיקלוס פאלקוביץ ' ואחרים מתארים את הטכניקות הבסיסיות בפירוט14,15. מצגת זו בעיקר לאחר העבודה המקורית, עם כמה שיפורים כדי להקל על היעילות ולהקטין את ההוצאות של הציוד הדרוש. למשל, מקטעים מהמוח נעשים בבלוק מוחי קפוא ולא בקריוסטט. זה מייצר סעיפים עבה יותר אשר מפחית את מספר הסעיפים הדרושים כדי לאסוף דגימות ROI. שיטה זו גם מבתר דגימות על צלחת זכוכית קפואה שיושבת על קרח יבש בתוך קופסה מבודדת. זה יוצר שלב מקפיא בספסל שעליו לעבוד. מקטעים גזור בדרך זו הם מניקל בקלות לתרגום, המאפשר לחוקר להשוות את שני הצדדים של כל מקטע עם התייחסות על מנת להגביל את הזיהום מאזורים מחוץ ROI הרצוי.
היתרונות של פרוטוקול זה הם 1) המוח נשמר במצב קפוא לאורך כל התהליך, אשר מסייע לשמר את חומצות החלבון והגרעין ונותן את הזמן החוקר ROIs הקציר בזהירות, ו 2) ריאגנטים נדרש הם זולים נמצאים במעבדות הביולוגיה המולקולרית ביותר. בתהליך זה, מוחות שלמים מנות עד 0.5-1.0 מ"מ במטריצת מוח ומניחים על צלחת זכוכית קפואה כי הוא מקורר ברציפות עם קרח יבש. ציוני דרך שנמצאו במוח אלן אטלס1 או אטלסים המוח אחרים16,17 משמשים כדי לזהות אזורים של עניין, אשר לאחר מכן לגזור באמצעות אגרוף קר או אזמל. כי הרקמה מעולם לא הופפה, אזורים שנקטפו באופן זה לספק באיכות גבוהה RNA וחלבונים עבור ניתוחי במורד הזרם.

<table><tbody><tr><td>0.5 מ"מ עכבר מטריצת מוח קורונלית</td><td>Braintree Scientific</td><td>BS-SS 505C</td><td>בלוק חיתוך</td></tr><tr><td>0.5 מ"מ מטריצת מוח קורונלית עכברוש</td><td>Braintree Scientific</td><td>BS-SS 705C</td><td>בלוק חיתוך</td></tr><tr><td>1.0 מ"מ אגרוף ביופסיה עם בוכנה</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>69031-01</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>נקודה מדעית</td><td>229443</td><td>לאחסון החזר ROI קפוא</td></tr><tr><td>1.5 מ"מ ביופסיה פונץ' עם בוכנה</td><td>אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית</td><td>69031-02</td><td></td></tr><tr><td>2.0 מ"מ ביופסיה פונץ' עם בוכנה</td> אלקטרונים <td>מיקרוסקופיה מדעי</td><td>69031-03</td><td></td></tr><tr><td>4-12% NuPage ג'ל</td><td>Invitrogen</td><td>NPO323BOX</td><td>חלבון שיפוע ג'ל</td></tr><tr><td>ביו-אנלייזר מערכת</td><td>ניתוח Agilent</td><td>2100</td><td>RNA</td></tr><tr><td>מטחנת רקמות Dounce</td><td>Millipore Sigma</td><td> D8938</td><td>הומוגנייזר רקמות זכוכית</td></tr> סיבי <tr><td>קרח</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>יבשים לייט</td><td>דולן-ג'נר תעשיות בע"מ</td><td>דגם 180</td><td>מנורת מגניב</td></tr><tr><td>לוחות זכוכית</td><td>LabRepCo</td><td>11074010</td><td></td></tr><tr><td>HALT</td><td>ThermoFisher</td><td>78440</td><td>קוקטייל מעכב פרוטאז</td></tr><tr><td>להבים בפרופיל נמוך</td><td>Sakura Finetek USA Inc.</td><td>4689</td><td></td></tr><tr><td>עכבר נוגדן נגד אקטין</td><td>מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה</td><td>JLA20</td><td>נוגדן</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>2000C</td><td>משמש בניתוח טוהר RNA ראשוני</td></tr><tr><td>מס' 15 להב כירורגי</td><td>עיצוב כירורגי בע"מ</td><td>17467673</td><td></td></tr><tr><td>מאגר חסימת אודיסיאה</td><td>LiCor Biosciences</td><td>927-40000</td><td>מגיב</td></tr> <tr>חוסם מערבי<td>Omni Tissue Master 125</td><td>VWR</td><td>10046-866</td><td>הומוגנייזר רקמות</td></tr><tr><td>ארנב אנטי-KCC2 נוגדן</td> טכנולוגיית <td>איתות תאים</td><td>94725S</td><td>נוגדן</td></tr><tr><td>RNA פלוס מיקרו קיט</td><td>Qiagen</td><td>73034</td><td>משמש לחילוץ RNA מדגימות רקמה קטנות</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>ידית אזמל</td><td>Excelta Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סכיני גילוח סטנדרטיים</td> 16050103 <td>American Line</td><td>66-0362</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596026</td><td>משמש להפקת RNA מרקמות</td></tr></tbody></table>

אוסף של אזורים קפואים המוח מכרסם עבור ניתוח במורד הזרם

Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses

כמו ההבנה שלנו של נוירוביולוגיה התקדמה, ניתוחים מולקולריים מבוצעים לעתים קרובות על אזורים במוח קטן כגון קליפת האמצעי המדינטלית (mPFC) או גרעין accumbens. האתגר בעבודה זו הוא לנתח את השטח הנכון תוך שמירה על המיקרו-סביבה להיבדק. במאמר זה, אנו מתארים שיטה פשוטה, בעלות נמוכה באמצעות משאבים זמינים ברוב המעבדות. שיטה זו שומרת על חומצת גרעין וחלבונים על ידי שמירה על הרקמה הקפואה לאורך כל התהליך. המוח הם חתכו לתוך 0.5 – 1.0 מקטעים באמצעות מטריצה המוח מסודרים על צלחת זכוכית קפואה. ציוני דרך בכל מקטע מושווים להפניה, כגון אטלס המוח של אלן העכבר, והאזורים הם גזור באמצעות איזמל קר או אגרוף ביופסיה. הרקמה מאוחסנת לאחר מכן ב-80 ° צ' עד השימוש. באמצעות זה עכברוש ועכבר התהליך mPFC, גרעין accumbens, ההיפוקמפוס והיפוגולי ואזורים אחרים נותחו בהצלחה באמצעות רביעיית-PCR ומערב assays. שיטה זו מוגבלת לאזורי מוח שניתן לזהותה באמצעות ציוני דרך ברורים.

על מנת לאמת את השיטה, הקליפה הפרונטלית המדידית נאסף מן המבוגר CD1 wildtype עכברים זכרים ו-RNA וחלבונים חולצו ומאופיין. רנ א נותח על ידי אלקטרופורזה קפילר. מושפל RNA מציג אובדן באינטנסיביות של להקות הריבוזומבית 28S ו-18S ומציג גם מוצרי השפלה ככתם בין 25 ו 200 נוקלאוטידים (איור 5A, לדוגמה 1). באיכות גבוהה RNA מראה להקות ריבוזומטיות נפרדות עם מעט לא אות באזור המשקל המולקולרי התחתון (איור 5A, מדגם 2). מספרי שלמות RNA (RINs) נוצרים גם הם בניתוח זה. RINs מעל 7 מצביעים...

הליך זה מתאר את אוסף אזורי המוח קפוא בנפרד כדי להשיג חלבון באיכות גבוהה ו-RNA באמצעות כלים זולים וזמינים בדרך כלל.

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex ...

הליך זה מתאר את האוסף של אזורי מוח קפואים דיסקרטיים כדי להשיג חלבון באיכות גבוהה RNA באמצעות כלים זולים זמינים בדרך כלל. מכיוון ואזורי מוח נשמרים קפואים מהקציר באמצעות ניתוח, מולקולות היעד נשמרות והחוקר יש זמן לנתח ולאחסן בזהירות אזורים מעניינים. זיהוי אזורי עניין יכול בתחילה להיות מאתגר.שימוש בציוני דרך נפוצים במוח כשהם מגיחים ונ נסוגים דרך החלקים ביחס לאזורים הרצויים יבהיר את הזיהוי. לאחר הסרת מוחות מעכברי CD-1 פראיים בוגרים שעברו המתת דם, פלאש מקפיא את הרקמה למשך 60 שניות בחנקן נוזלי או באירופנטאן. מצננים מראש עם קרח יבש ומאחסנים אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס.24 שעות לפני ניתוח הרקמה, מניחים מטריצת מוח נקייה על ערימה של חבילות מקפיא מופשרות. וכריך את הצדדים למטריצה בין שתי חבילות מקפיא הקפדה להשאיר כחצי סנטימטר בין החלק התחתון של חריצי התער ואת החלק העליון של האריזות. הגדר צלחת זכוכית קפואה עבור הניתוח על ידי מילוי קופסה מבודדת עם קרח עד כחמישה סנטימטרים מלמעלה.לאחר מכן מניחים שכבה של 2.5 ס"מ של קרח יבש על גבי. ולכסות אותו עם יריעות פלסטיק שחורות. מניחים צלחת זכוכית על גבי הפלסטיק.וקרח יבש סביב גבולות הצלחת. מוציאים את מטריצת המוח הקפואה מהמקפיא ומכניסים את המוח, את קליפת המוח למעלה, למטריצה. אפשר לרקמה לצייד לטמפרטורה בתיבה במשך 10 דקות.שמירה על המכסה פתוח במהלך תקופה זו. השתמש ב

collection-of-frozen-rodent-brain-regions-for-downstream-analyses

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

Micro-לנתיחה במוח חולדה לתוך אזורים שונים מאוד חשוב לחקר מחלות ניווניות שונות. וידאו זה מדגים דיסקציה מיקרו ארבעה אזורים במוח העיקריים כוללים נורת חוש הריח, הקורטקס פרונטלי, היפוקמפוס ו בסטריאטום ברקמת מוח החולדה טרי. עצות שימושיות עבור סילוק מהיר של האזורים השונים, כדי למנוע פירוק חלבונים ו-RNA של הרקמה מקבלים.

Micro-דיסקציה של מוח החולדה עבור הפקת RNA או חלבון מן אזור מסוים במוח

פרופיל ביטוי של RNA מאזורים מובחנים במוח של עכבר דורש אסטרטגיה מדויקת וחזרתית לאיסוף רקמות. כאן מתואר פרוטוקול המשתמש הן בחיתוך קורונלי של המוח והן במיקרודיסקציה בעזרת מחלל רקמות (tissue corer). התנובה והאיכות של ה-RNA הכולל שהתקבל מהדגימות שהופקו מאשרות את יעילותו של המהלך המתואר.

Non-לייזר מיקרוסקופית לכידת גישה עבור Microdissection של אזורים במוח דיסקרטית עכבר עבור בידוד RNA סך סידור Downstream הדור הבא והביטוי פרופיל גנטי

אנו מתארים מודל עכברים של הפרעת פוסט טראומטית (PTSD) החושפת את השינויים המתמשכים בתפקוד נוירואנדוקריניים ותגובה המאוחרת לטווח ארוך, המוגזמת פחד, אופייניים לחולי PTSD. מודל החיה ושיטות שתוארו כאן הם שימושיים עבור correlating סמנים ביולוגיים בגרעיני מוח, שהם מכאניים אך לא ניתן למדוד בחולים, עם סמנים ביולוגיים בתאי דם לבן בפריפריה, שיכול.

סמנים ביולוגיים במודל חיה לחשיפה קושרת עצבית, המטולוגית, והתנהגות של PTSD

סרטון זה מדגים פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב להכנת מקטעי רקמת מוח של עכברים קפואים לניתוחים במורד הזרם.

עיבוד מוח של עכבר לניתוח במורד הזרם

אנו מתארים את השימוש בלייזר microdissection לכידת להשיג דגימות של אוכלוסיות תאים נפרדים של אזורים שונים במוח עבור ג'ין וניתוח microRNA. טכניקה זו מאפשרת חקר ההשפעות דיפרנציאלית של פגיעה מוחית טראומטית באזורים ספציפיים של המוח חולדה.

לייזר מונחה אטלס סטיאוטטי ללכוד את Microdissection של אזורים במוח מושפע פציעה טראומטית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול הקפאה של סעיף רקמת מוח מחיות מרובים כחלופה ייעול עיבוד המוח יחיד. זה מפחית את השתנות מכתימים במהלך אימונוהיסטוכימיה, מפחית את הזמן cryosectioning והדמיה.

Cryosectioning בו זמנית של המוח מכרסמים מרובים

אנו מספקים פרוטוקול עבור בידוד של מיקרוגלייה מאזורים בגזור שונים של המוח העכבר באמצע המחצית, ואחריו הכנה חצי אוטומטי הספריה לרצף העמוק של RNA תא בודד של טרנססקריפט באורך מלא. שיטה זו תסייע להבהיר טרוגניות תפקודית של מיקרוגלייה בריאות ומחלות.

בידוד של אזור-מיקרוגליה ספציפי מתוך חצי הכדור השני של המוח העכבר עבור רצפי RNA של תא יחיד בודד

אזורים מוחיים שונים כבר מעורבים לשחק תפקיד תפוקות התנהגותיות ברורות, עדיין המנגנונים המולקולריים הבסיסיים עדיין לא ידוע. עבודה זו מתארת שיטה להתרבות במהירות ולנתח קליפת המוח המוח הקטן של חצי הכדור, האזורים הקדמיים והאחוריים של ורמיס, ואת גרעיני המוח הקטן העמוקים על מנת לחקור הבדלים מולקולריים על ידי בידוד RNA ובדיקת הבדלים בביטוי הגנים.

ניתוח אזורי של Cerebellar לניתוח מולקולרי

אנו מציגים פרוטוקול מהיר, שלב אחר שלב, להסרת מוח עכבר ודיסקציה של אזורים בדידים מרקמת מוח טרייה. השגת אזורי מוח לניתוח מולקולרי הפכה לדבר שבשגרה במעבדות רבות למדעי המוח. אזורי מוח אלה מוקפאים באופן מיידי כדי לקבל נתוני תעתיק באיכות גבוהה לניתוח ברמת המערכת.

מיקרו-דיסקציה של מוח העכבר לאזורים שונים מבחינה תפקודית ואנטומית

כאן אנו מציגים שיטה אוטומטית לקביעה כמותית למחצה של מספר נוירון דופאמין בסובסטנציה חולדה nigra pars compacta.

קביעה כמותית למחצה של צפיפות נוירון דופאמין בסבסטנציה ניגרה של מודלים מכרסמים באמצעות ניתוח תמונה אוטומטי

למדו איסוף אזורי מוח קפואים מעכברי CD-1 לקבלת חלבון ו-RNA באיכות גבוהה. שיטה זו שומרת על שלמות המולקולות ומאפשרת ניתוח מורכב במורד הזרם.

אוסף של אזורים קפואים המוח מכרסם עבור ניתוח במורד הזרם

גלה סרטונים נוספים