ב Vivo הגדלת האינדוקציה תא T הרגולציה התקינה של הבטן

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור בvivo הגדלת הרגולטורים של הבטן הרגולציה האינדוקציה תא T. בפרוטוקול זה, תאים דנדריטים מהונדסים מקומית לייצר ריכוזים גבוהים של ויטמין D הפעיל (1, 25-דיהידרוטסטוסטרון ויטמין D או 1, 25 [הו]₂ד) ו ויטמין פעיל (חומצה RETINOIC או RA) דה נובו.

פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיה טיפולית חדשנית שניתן לשנות בקלות עבור יישומים אנושיים. טכניקה זו משפרת ישירות את אינדוקציה של תאי T רגולטוריים ביות המעיים ברקמות הלימפה ההיקפיות והוא יכול להיות מיושם באופן הדוק אפילו בסביבות פרו דלקתיות מאוד. טכניקות אלה יכולות לשמש גם כדי לחקור את התפקיד של ויטמין D פעיל וויטמין A בתוך המערכת החיסונית ההיקפית.

הדגמה חזותית זו תספק הוראות צעד אחר צעד עבור הדור של תאים דנדריטיים מהונדסים באיכות גבוהה שהם קריטיים להצלחת טכניקה זו. התחל על ידי זריעה אחת 10 כדי שבעה תאים 293T ב 20 מיליליטר של CM-10-D תאים בינוני ב 150 על ידי 25 מילימטר צלחות תרבות עבור דגירה 24 שעות ביממה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. למחרת, להוסיף 1.62 מיליליטר של פתרון HBS מרוכז טרי מוכן פעמיים, 9.5 מיקרוגרם של פלסמיד מעטפה, 17.5 מיקרוגרם של פלסמיד אריזה, ו 27 מיקרוגרם של פלסמיד LENTI-CYP-ALDH לצינור חרוט 50 מיליליטר.

להביא את הנפח הסופי של תכולת הצינור עד 3.0375 מיליליטר עם מים ואחריו תוספת של 202.5 microliters של שני סידן טוחן כלורי dropwise. השאירו את תערובת משקעים DNA בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות עם ערבוב מדי פעם לפני הוספת 3.24 מיליליטר של הפתרון dropwise לכל תרבות 293T תוך מערבולת בעדינות את המנה. מניחים את הצלחות באינקובטור במשך 24 שעות לפני שטיפת כל צלחת בעדינות עם PBS והאכלת התאים עם CM-4-D תרבות בינונית.

לאחר 24 שעות נוספות של תרבות, לקצור את supernatants לתוך בקבוקים סטריליים לאחסון בארבע עד שמונה מעלות צלזיוס ולהאכיל את התאים עם מדיום CM-4-D טרי במשך 24 שעות נוספות. ביום הרביעי, לקצור את supernatants שוב מאמץ את supernatants משני הימים שלושה וארבעה למסנן מיקרומטר 0.45. לאחר מכן, לרכז את וירוס פסאודוטיפ VSV-G על ידי צנטריפוגה במשך 24 שעות.

למחרת תכרית את העל-טבעיים. אפשרו לצינורות לנקז על מגבת נייר בארון ביו-בטיחות סטרילי למשך מספר דקות, ולאחר מכן להשתמש שוב כדורי ב 33.3 microliters של PBS סטרילי המכיל 5% גליצרול לכל צלחת תרבות. עבור ייצור תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם, מניחים את השוקיות ועצם הירך, שנקטפו מעכברי BALB/c, לתוך צלחת תרבות של 100 על 20 מילימטר המכילה מדיום תרבות טרי.

השתמש ניתוח מספריים ומדפים כדי להסיר את כל הרקמות מן העצמות. כאשר כל העצמות נוקו, השתמש במספריים כדי לחתוך את שני הקצוות של כל עצם כדי לחשוף את חללי מח העצם. השתמש מזרק 10 מיליליטר מצויד מחט 30 מד לשטוף כל עצם עם 10 מיליליטר של מדיום תרבות טרי, איסוף מח העצם בצינור 15 מיליליטר.

כאשר כל מח העצם נאסף, מים את מח העצם על ידי צנטריפוגה ו resuspend גלולה בשני מיליליטר של חיץ תמוגה תא דם אדום. לאחר ארבע עד חמש דקות בטמפרטורת החדר עם רעידות מזדמנות, לעצור את התגובה עם 10 מיליליטר של מדיום תרבות התא ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. תן שימוש חוזר את גלולה ב 10 מיליליטר של CM-10-R תרבות בינונית לספירה ולהתאים את התאים עבור אחד פעמים 10 לשישה תאים למיליליטר של ריכוז בינוני תרבות CM-10-R.

לאחר מכן, להוסיף 100 יחידות למיליליטר של מרין רקומביננטי GM-CSF ו 10 יחידות למיליליטר של IL-4 לתאים. צלחת ארבעה מיליליטר של תאים לתוך בארות בודדות של צלחת תרבות 6 היטב עבור הדגירה שלהם ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 48 שעות. בסוף הדגירה, השואבים בעדינות את התאים שאינם חסידים.

הוסיפו מדיום טרי בתוספת GM-CSF ו-IL-4 לתרבויות לפני החזרת התאים לחממת תרבות התאים לתוספת של 48 שעות. בסוף הדגירה השנייה, לקצור את מח העצם שאינו חסיד נגזר תאים דנדריטיים לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר עבור הצנטריפוגה שלהם. כדי ליצור תאי BMDC-CYP-ALDH, יש להשתמש מחדש בתרבות בתאים דנדריטיים פי עשרה עד השישי לכל 500 מיקרוליטרים של CM-10-R בינוני לריכוז באר, וללחוץ 500 מיקרוליטרים של תאים לכל באר של צלחת תרבות חדשה של שש בארות.

הוסף 50 microliters של וירוס LENTI-CYP-ALDH ו 8 מיקרוגרם למיליליטר של פרוטמין לכל באר, ולאחר מכן למקם את הצלחת באינקובטור במשך 24 שעות. למחרת, החליפו את העל-טבעיים במדיום תרבות טרי והחזירו את הצלחות לחממת תרבות התאים למשך 24 שעות נוספות. בסוף הדגירה השנייה, התאים יכולים להיות מופעלים עם 100 ננוגרם למיליליטר של lipopolysaccharide ל הבאר במשך 24 שעות לפני הקציר לניתוחים פונקציונליים.

בהשוואה לתאים דנדריטיים המופקים מעצם הורית, תאי BMDC-CYP-ALDH מציגים ביטוי משופר של 1-אלפא-הידרוקסילאז. הריכוזים של הצורה הפעילה של ויטמין D בתרבות supernatants של BMDC-CYP ותאי BMDC-CYP-ALDH גבוהים בערך פי 20 מאלה שנצפו במח העצם ההורי נגזר תא דנדריטי ותרבות התאים BMDC-ALDH. התעצמויות הפלואורסצנטיות הממוצעות של תאי BMDC-CYP-ALDH שטופלו במצע גבוהות בערך פי שישה מאלה של תאי דנדריטיים שמקורם במח העצם ההורית שטופלו במצע.

הדבר מצביע על כך שתאי BMDC-CYP-ALDH מבטאים פעילות אנזימטית משופרת באופן משמעותי של הרשתית דה-יהידהידרוגנאז-2. DC2.4 תאים שטופלו 25-הידרוקסי ויטמין D ברשתית אינם גורמים לשינוי משמעותי בשפע של foxp3 חיובי CCR9 חיובי CD4 חיובי T תאים. לעומת זאת, תאי DC2.4 CYP-ALDH שטופלו בויטמין D 25-הידרוקסי ורטינאלי גורמים למספרים גבוהים משמעותית של תאי T רגולטוריים ביות המעיים באופן תלוי ריכוז.

יתר על כן, בהשוואה לתאי בקרה מוזרקים תוך-פרטית, תאי DC CYP-ALDH גורמים גם לעלייה משמעותית במספר תאי ה- CD4 החיוביים החיוביים של CD4 לאחר הזרקה תוך-פרטית לבעלי חיים בעלי נמעני BALB/c. הצלחת ההליך תלויה בהכנת תאי T בריאים ותערובת דנ"א מוכנה כראוי.