חקירת חילוף החומרים של קסנוביוטיקה בעלי אלבה סליקס באמצעות הדמיה ספקטרומטרית מסה

שיטה זו משתמשת בהדמיית ספקטרומטריית מסה (MSI) כדי להבין תהליכים מטבוליים בעלי S. alba כאשר הם נחשפים לשנאת קסנוביוטיקה. השיטה מאפשרת לוקליזציה מרחבית של תרכובות מעניינות ואת המטבוליטים החזויים שלהם בתוך רקמות ספציפיות ושלמות.

פרוטוקול זה מאפשר זיהוי ישיר של מטבוליטים חזויים באתרם. זה מקל על קביעת סוג הרקמות או התאים המושפעים מתהליך מטבולי ספציפי. שיטה זו מהירה ופשוטה.

זה לא דורש הכנת דגימה מסובכת או מיצוי תרכובות, והוא מאפשר זיהוי ולוקליזציה של תרכובות בשפע נמוך. עם רכישת הדגימה הביולוגית, יש לקרר מחזיק דגימת מיקרוטום קריו ולהב למינוס 20 מעלות צלזיוס. במידת הצורך, שפכו את מדיום ההטבעה לתבנית פלסטיק המונחת בתוך תא המיקרוטום הקריו והוסיפו במהירות את הדגימה למדיום.

מכסים את הדגימה במדיום הטבעה נוסף ומתאימים את מיקום הדגימה למרכז התבנית לפי הצורך ככל שהמטריצה מתמצקת. כאשר הדגימה מוכנה, השתמש במדיום הטבעה כדי להרכיב את הרקמה על מחזיק המיקרוטום הקריו והשתמש בלהב המקורר כדי לחתוך את הרקמה לחלקים בגודל מתאים, לשנות את עובי החיתוך והטמפרטורה לפי הצורך כדי להשיג דגימות אופטימליות. כאשר כל חלק נרכש, השתמש בכלי מתאים כדי להעביר בזהירות את הפרוסה לשקופית מיקרוסקופ זכוכית מצופה תחמוצת פח אינדיום, והנח אצבע מתחת לשקופית כדי לחמם ולייבש את הדגימה לפני הכנסת השקופית לתא המיקרוטום הקריו.

לאחר שכל הפרוסות נרכשו, הסר לאט את השקופיות מהתא והשתמש בטוש מתאים כדי לציין את המיקום המדויק של כל דגימה בשקופיות. לאחר שכל השקופיות סומנו, השתמש בסורק ברזולוציה גבוהה כדי לסרוק את הדגימות. לאחר הסריקה, נקו את רובוט תצהיר המטריצה עם 100% מתנול, והשתמשו במתנול ובמגבון מדויק כדי לנקות כל שקופית, להחזיק את הדגימות מבלי לגעת בהן ומבלי להסיר את הסימנים.

הנח כיסוי נקי מעל כל שקופית באזור ללא דגימה והנח את קצה הכיסוי של המגלשה הראשונה מעל הגלאי האופטי, ולאחר מכן הנח לא יותר משישה מיליליטר של תמיסת מטריצה טרייה שהוכנה במאגר תצהיר המטריצה והוסף שני מיליליטר של 100% מתנול לנפח כולל של שמונה מיליליטר. להגדרת רכישת נתונים, הנח מיקרוליטר אחד של מטריצה על צלחת MALDI והכנס את הצלחת למקור. לחץ על טען יעד בתוכנת המכשיר ולחץ על הנקודה בתמונה המייצגת את לוחית MALDI כדי לבחור את המיקום של נקודת המטריצה.

ציין את השם והתיקיה לדוגמה בכרטיסיית המידע לדוגמה. לחץ על רכישה כדי להתחיל את הרכישה והשתמש במצביע העכבר כדי להזיז מעט את הלוח כך שהלייזר יצביע בנקודות שונות. בסיום הרכישה, פתח את לשונית הכיול ובחר רשימת כיול HCCA במצב ריבועי ולחץ אוטומטי.

תוצאת הכיול הגלובלית תצוין בחלון עלילת הכיול. אם הכיול נמצא בטווח המתאים, לחץ על קבל ושמור את השיטה. לאחר סיום שקיעת המטריצה על הדגימות, הנח את השקופיות במתאם השקופיות והשתמש בכיסוי פלסטיק כדי לאחזר את מיקום הסימנים.

בתוכנת ההדמיה, הגדר הפעלת הדמיה חדשה בחלון הראשון שנפתח בתוכנה ותן שם להפעלת ההדמיה. בחר את ספריית התוצאות ולחץ על הבא. ציינו את גודל הרסטר, בחרו בשיטה שבה תשתמשו ולחצו על Next.

טען את התמונה האופטית משקופית סרוקה ולחץ על הבא. התמונה תיפתח בחלון רחב יותר ותניח את כיסוי הפלסטיק הנושא את הסימנים על לוחית MALDI כדי לשחזר את מיקומה ולהקל על ההוראה. תחת בקרת FTMS, מקם את היעד של חלון הווידאו MALDI במיקום המדויק של סימן ופתח הדמיה גמישה, ולאחר מכן לחץ על אותה נקודה בדיוק בתמונה האופטית.

השתמש בכלי הוספת אזורי מדידה כדי לצייר את אזורי העניין בדגימות ולשמור את ריצת ההדמיה. אם יש לנתח מספר דוגמאות, הפעל את רצף ההפעלה האוטומטית והשתמש בהפעלה אוטומטית של רץ אצווה כדי להפעיל רצף. לאחר שכל התמונות הושגו, השתמש בכלי ייבוא האצווה כדי לבחור את הנתונים הגולמיים, לציין את ספריית היעד וללחוץ על ייבוא.

לחץ על קובץ וחדש כדי לבחור את כלי ערכת הנתונים כדי לבחור את סוג המכשיר המשמש לרכישה ולחץ על פלוס כדי להוסיף את ערכת הנתונים המיובאת. לחץ וגרור כדי לסדר את התמונות ולבדוק ולשנות את הגדרות טווח המסה לפי הצורך. לחץ על הבא כדי לראות את סיכום הייבוא ולהפעיל את הייבוא.

דמיין את יחס המטען הראשי ברקמות שונות בתוך דגימה או בין דגימות שונות ולחץ על ספקטרום כדי לבחור את יחסי המסה למטען המעניינים. ייצא את יחסי המסה לטעינה של עניין כקובץ CSV מכרטיסיית האובייקט ולחץ על ייצוא. צור מערך נתונים חדש בתוכנת הערות ולחץ על פרויקטים וייבא פרויקט CSV כדי לייבא את קובץ ה-CSV לתוכנה.

הוסף הערות עם רשימות אנליטים מותאמות אישית, שניתן לגזור ממאגרי מידע זמינים לציבור. תבנית ניתנת על ידי התוכנה ליצירת רשימות אנליטים. השתמש בתוכנת החיזוי כדי לבצע חיזוי בסיליקו של המטבוליטים של התרכובות המבוארות.

שחזר את רשימת המטבוליטים, צור רשימת אנליטים והשתמש ברשימה בתוכנת ההערות כדי להוסיף הערות לנתונים הגולמיים עם מטבוליטים חזויים, ולאחר מכן לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על המטבוליט החזוי המעניין כדי לשחזר את שמות האנזימים המעורבים בתהליכים המטבוליים בתוכנת החיזוי. בדוגמה זו, נקבע כי התרופה Telmisartan מופצת בכל דגימות רקמת עלי הצמח. מטבוליטים של התרופה נחזו וחיפשו בנתונים הגולמיים, וההערות חשפו כי מטבוליט אחד מהדור הראשון זוהה ברקמות הפנימיות של העלים והתפרק עוד יותר למטבוליטים מהדור השני שהיו ממוקמים ברקמות פנימיות או מפוזרים באופן כללי יותר בכל רקמות העלים.

תוצאות אלה מצביעות על תגובה מטבולית פעילה בעלים לפירוק Telmisartan. לאחר מכן יושם התהליך על מספר תרכובות מעניינות המובאות בעלים והאנזימים המעורבים בתגובות שוחזרו כדי לחקור את תפקידם בתגובת הצמח להצטברות קסנוביוטית. למרות שהליך זה הוא די פשוט, הכנת מדגם טובה היא המפתח.

הקפד להקדיש זמן כדי למצוא את הפרמטרים המתאימים לסוג הדגימה שלך במהלך חיתוך הרקמות. ניתן להשתמש בגודל המדגם לתצפיות מיקרוסקופיות. ניתן לצבוע אותו כדי לקבל פאנל של תצפיות ביולוגיות משלימות.