Y-27632 מעשיר את התשואה של מלנוציטים אנושיים מרקמות עור למבוגרים

המטרה הכללית של פרוטוקול התאים מבוסס היא לבודד ולתרבת תאים מלנוציטים אנושיים, שיפור החסרונות של שיטות קונבנציונליות. מהשיטה החדשה אנו יכולים לקבל כמויות גדולות יותר של תאי מלנוציטים ראשוניים בזמן קצר יחסית, המבוסס על חומרים וציוד. רקמות אנושיות המשמשות בפרוטוקול זה הן מבוגר טרי עבור רקמות העור שהושלכו מניתוח ברית מילה בבית החולים וטופלו על פי הנחיות ועדת האתיקה של המחקר האנושי של המכון מספר 2015120401, תאריך מאי 12 2015.

זוהי תצוגה של כל חברי ההנהלה הנדרשים. הכינו מראש מכשירים וחומרים סטריליים והניחו את הרקמה על צלחת, שטפו את הרקמה ב-75% אתנול למשך 30 שניות ועם תכשירי שטיפה קושרים חמש דקות כל אחד חותך את הרקמה לחתיכות נוחות ומגרד את הרקמה בלהב כירורגי להסרת שכבת השומן. לשטח את הרקמות עם הצד הדרמיס למטה להוסיף 2.5 מיליגרם למיליליטר פתרון החלל לרקמות העור.

מכסים ומאחסנים את החתיכות בארבע מעלות צל"ש בן לילה. ביום השני, לקלף את האפידרמיס מן הדרמיס מיד להעביר את האפידרמיס לתוך עוד שלוש מנות עם פתרון כביסה בתורו שקוע 0.05% טריפסין בצינור דגירה במשך 30 דקות באמבט מים ב 37 מעלות צלסיאדה. הוסף נפח שווה של פתרון הנטרול.

Pipettes הפתרון למעלה ולמטה במשך 10 עד 15 פעמים. להעביר את הפתרון דרך מסנן מחית 100 מיקרומטר. צנטריפוגה ב 200 פעמים g במשך חמש דקות להסיר את על טבעי להשעות מחדש את משטח התא ב 10 מיליליטר של מדיום טיווה.

הוסף 10 מיקרומטר של Y-27632. סמן את המידע זהו שדה הצפייה מתחת למיקרוסקופ. הוא מראה תאים צפים באינקובטור בינוני ב-37 מעלות צלסיאד.

תצוגה זו מציגה את התצוגה ביום השני התאים החלו לצרף את החלק התחתון של המנה. והנוף ביום התשיעי מראה פיקדונות ברורים של מלנוציטים קיימים. הסר את supernatant לשטוף את התאים עם PBS להוסיף שני מילימטר של 0.05% טריפסין דגירה התאים במשך שתי דקות להוסיף שני מיליליטר של פתרון הנטרול.

צנטריפוגה ב 200 פעמים g במשך חמש דקות. הסר את העל-טבעי לאט לאט להשעות את משטח התא עם 10 מילימטר של מדיום טיווה. שנה את המדיום כל יומיים.

תמונות אלה מציגות את התצוגות של דיאגרמת מעבר סכמטית אחת כך השיטה החדשה ואת השיטה הקונבנציונלית מוצגים איור זה. ההליך להכנת רקמות ועיכול של שיטה חדשה זהה לשיטה המקובלת. ההבדל היחיד הוא שתאי השומן המבודדים מחוסנים בעוד 10 דקות במדיום הטיבה שלה בנוכחות 10 מיקרומטר Y-27632.

לאחר יומיים להחליף את התקשורת עם מדיום טיווה ללא תוספי מזון ב Y-27632. פאנל זה מציג תמונות מייצגות של melanocytes שהוכנו על ידי השורה העליונה שיטה קונבנציונלית ועל ידי השורה התחתונה שיטה חדשה ביום השלישי, יום שש ויום שמונה לאחר החיסון הראשוני אנו מכנים את מספר melanocytes ביום שלוש, יום שש ושמונה, מצאנו כי השיטה החדשה הגדילה את התשואה melanocytes על ידי כחמש פעמים. אחרי שמונה ימים לפני כן עשינו תריסר וספירנו את מספר המלנוציטים בכל מנה בודדת.

התוצאות הראו כי מספר המלנוציטים המבודדים בשיטה חדשה הוא הרבה יותר מאשר השיטה המקובלת. Ki67 עומד לאשר כי melanocytes מבודדים על ידי שיטה חדשה בדרך כלל יכול להתרבות חשוב יותר השגנו תפקוד תקין של melanocytes עם השיטה החדשה. בדקנו את טוהר המלנוציטים לאחר המעבר הראשוני מהבידוד.

הקטע מלנוציטים אחד עבור לעמוד על ביטוי MITF אשר בא לידי ביטוי רק מלנוציטים. ומצאנו כמעט 100% תאים היו חיוביים עבור MITF המציין מלנוציטים טהורים שהושגו לאחר המעבר הראשון. כדי לבדוק מלנוציטים מבודדים מן השיטות החדשות יכול לתפקד כרגיל.

טיפלנו melanocytes עם קירור כוח עבור מעל 90 במבחנה ולבחון כי קירור כוח יכול לגרום פיגמנטציה של melanocytes. אם לוקחים את הנתונים האלה יחד מרמז כי melanocytes מבודד מהשיטה החדשה יכול בדרך כלל לייצר פיגמנטציה. מלנוציטים ראשוניים, כאמור מעל העור ומורחבים בתרבות שימשו בקלות למחקר מעבדה וליישומים הקליניים.

לאחר שדיווח כי ID Y-27632 לתוך מדיום התרבות הראשונית לפני יומיים יכול להגדיל באופן דרמטי את המלנוציטים. לסיכום, הקמנו בהצלחה שיטה פשוטה ויעילה מאוד לבודד מלנוציטים ראשוניים טהורים מרקמות בוגרות.