מזעור היפוקסיה בפרוסות היפוקמפוס מעכברים מבוגרים ומזדקנים

זהו פרוטוקול להכנת פרוסה חריפה מהיפוקמפוס עכבר מבוגר ומזדקן המנצל את התסיסה הקרדיאלית וחיתוך פרוסה עם NMDG-aCSF קר כקרח כדי להפחית את הנזק היפוקסי לרקמות. הפרוסות המתוברות נשארות בריאות במשך שעות רבות, ומתאימים לטלאים ארוכי טווח ולהקלטות שדה.

הפרוטוקול המוצג כאן מפחית נזק היפוקסי מוגזם במהלך הכנת פרוסות היפוקמפוס עכבר בוגר ומזדקן, ובכך מסיר מכשול מרכזי לחקר תפקוד המעגלים העצביים הבוגרים והמזדקנים. מבוא של היפותרמיה בפתרונות ללא נתרן תוצאות פרוסות ההיפוקמפוס כי הם בריאים עד 10 שעות לאחר חיתוך ומתאים הן עבור הקלטות שדה לטווח ארוך מחקרים מהדק טלאי. שיטה זו של הכנת פרוסות היפוקמפוס יכולה להיות רלוונטית במיוחד עבור מודלים של בעלי חיים במחלות ניווניות שמעצם הגדרתן דורשות הכנת מוח מזדקן.

הצעד הקריטי ביותר בפרוטוקול זה הוא החדרת היפותרמיה באמצעות שפע טרנסקרדיאלי עם פתרון קר כקרח. עם תרגול מסוים, החוקרים יוכלו לבצע צעד זה באופן אמין. התחל על ידי הכנת ליטר אחד של פתרון aCSF עבור תא ההתאוששות והקלטות הבאות.

לאחר מכן הכינו 300 מיליליטר של NMDG-aCSF לצעדי ההתגלות והחיתוך הטרנס-קרדיאליים. מניחים את מגש חיתוך המיקרוטום הרוטט ואת דיסק ההרכבה במקפיא של מינוס 20 מעלות צלזיוס. כדי להכין את תא ההתאוששות, למלא אותו רק מעל פרוסת מחזיק רשת ולהתחיל את הבועה שמירה על התא על הספסל בטמפרטורת החדר.

מצננים את כל 300 המיליליטרים של NMDG-aCSF במקפיא עד גבישי קרח מתחילים להיווצר על פני השטח ועל קירות הבקבוק. מניחים את הבקבוק עם מצונן NMDG-aCSF על קרח בועה זה, שמירה על הפתרון בין אפס לשתי מעלות צלזיוס. מוציאים את הדיסק להרכבת הרקמות מהמקפיא ומנגבים אותו יבש, במידת הצורך.

חותכים בלוק של 5% אגר על הגודל של מוח העכבר ולהדביק אותו במרכז הדיסק באמצעות שכבה דקה של דבק cyanoacrylate. מניחים את הדיסק עם אגר מודבק על קרח ומכסים אותו במגבות נייר עד מוכן לשימוש. מוציאים את מגש החיתוך מהמקפיא, מניחים אותו במיקרוטום, ואז מקיפים אותו בקרח ועומסים את הלהב.

הכן את כל הכלים מראש עבור ניתוח המוח. הגדר את המשאבה הפריסטואלית לזלוד ארעי. הכנס צד אחד של צינורות המשאבה לתוך הבקבוק עם NMDG-aCSF קר להתאים את הצד השני עם מחט 27 מד.

הגדר את מהירות המשאבה לכ-3.5 מיליליטר לדקה. במהירות זו, הזרימה של NMDG-aCSF היא נסיעה מהירה, לא זרימה רציפה. מניחים את העכבר על גבו על חיתול.

לפני שתמשיך, אישר כי העכבר נמצא במישור כירורגי של הרדמה על ידי ביצוע צביטה בוהן. העכבר צריך להיות לא מגיב, ואז מודבק במורד רגליו הקדמיות והיש מאחור, כך החזה והבטן חשופים. חותכים חלק גדול של העור על החזה, הולך מתחת עצם החזה אל הגרון.

תופסים את עצם החזה במדפים, מרימים אותה בעדינות ומתחילים לחתוך דרך כלוב הצלעות משני הצדדים עד שנחשף חלל החזה. חותכים דרך הסרעפת, משאירים את הדש של כלוב הצלעות מחובר דרך חתיכה דקה של שריר. זה צריך להיות אפשרי לשים אותו בצד מבלי שזה ייפול בחזרה על חלל החזה החשוף.

בדוק כי הלב עדיין פועם ולוודא כי רוב הכבד גלוי. הכנס את המחט לחדר השמאלי, שנראה בהיר יותר בצבעו מימין. כדי לייצב את המחט, כונן אותו דרך הצלעות הנותרות בצד שמאל של הגוף.

אתר את ה אטריום הימני בצבע אדום כהה וחתוך דרכו במספריים קטנים. הדם צריך להתחיל לזרום החוצה. התחל את המשאבה ולהתבונן בכבד, אשר ישנה את הצבע מ אדום לחום.

לפקח על צבע הכבד ולהמשיך חליטה עד הכבד הופך חום חיוור. הפעל את המשאבה עוד כמה דקות. טמפרטורת הגוף של החיה צריכה לרדת ל 28 עד 29 מעלות צלזיוס והאף שלה צריך להיות קר למגע.

ערפו את ראשו של העכבר עם מספריים גדולים של עריפת ראש, ולאחר מכן השתמשו באזמל עם להב מספר 10 כדי לחתוך את העור על גבי הגולגולת. עם מספריים זוויתיים קטנים, חותכים את הגולגולת בקו האמצע. לאחר מכן, השתמש במדפים מספר שלוש כדי לחטט את החצאים הימניים והשמאליים של הגולגולת, נזהר לקחת את הדורה משם עם זה.

הסר את המוח, אשר צריך להיות צבע לבן על ידי גורף אותו עם מרית ושחרר אותו לתוך פתרון NMDG-aCSF על קרח. תשאיר את זה שם עד דקה. מוציאים את המוח מה-NMDG-aCSF ומניחים אותו על פיסת נייר סינון.

חותכים ומסירים טריז 60 מעלות של רקמה עם כלי 60 מעלות מרוכז בקו האמצע מקצה rostral של המוח הקדם. השתמש בצדדים החתוכים של משטח ההרכבה מכיוון שהוא מספק את הזווית המתאימה לפרוסות היפוקמפוס. הפרד את ההמיספרות לאורך קו האמצע עם האזמל והדבק אותן על דיסק ההרכבה.

קח את דיסק ההרכבה מהקרח ונגב אותו יבש, במידת הצורך. ואז להדביק כל חצי כדור מול גוש אגר, לחתוך את הצד כלפי מטה. ודא כי הצדדים הגחוני של שתי ההמיספרות נוגעים בלוק אגר ושצדדים הגביים של שתי ההמיספרות פונים אל הלהב.

כאשר מודבק בצד החתך, כל חצי הכדור צריך להיות מכוון יחסית ללהב באופן המבטיח פרוסות רוחביות של ההיפוקמפוס הגבי באתרו. להטביע את הדיסק עם ההמיספרות לתוך תא חיתוך המכיל קר כקרח פחמימות NMDG-aCSF. חותכים קטע 400 מיקרומטר, ולאחר מכן להשתמש פיפטה העברה חד פעמית עם קצה ניתוק כדי להעביר את הפרוסה לתא התאוששות המכיל פחמימות NMDG-aCSF בטמפרטורת החדר.

המשך לחתוך את שאר החלקים ולהעביר אותם לתא ההתאוששות לוקח לא יותר מ 10 דקות כדי לחתוך בסך הכל שמונה עד 10 פרוסות מאזור ההיפוקמפוס הגבי. הדגירה את הפרוסות בטמפרטורת החדר כשעתיים לפני ההקלטה. פרוטוקול זה שימש ליצירת פרוסות היפוקמפוס מעכברים בוגרים.

מספרים גדולים של תאים פירמידליים בשדה CA1 ובסוביקום מופיעים בניגודיות נמוכה, סימן ההיכר של תאים בריאים, כאשר הם נצפו תחת מיקרוסקופיה של ניגודיות דיפרנציאלית אינפרא-אדום. הקלטות מהדק טלאי ניתן להשיג נוירונים CA1 של עכברים כי הם מעל שישה חודשים. בניסוי לדוגמה כאן, התדירות של זרמים מיניאטוריים סינקרטיים נמדדה לאחר NMDA-LTD היה המושרה ביחס לתנאי הבקרה.

התדירות של זרמים מיניאטוריים סינטטיים סינפטיים הייתה נמוכה יותר בנוירונים לאחר אינדוקציה NMDA-LTD, המציין פעילות תלויה גיזום של תקצירים ב CA1. לא זוהו שינויים משרעת. במהלך הקלטות mEPSC, תאי CA1 היו גם מלאים biocytin ו arbor דנדריטי שלם הרגל תא בריא של נוירונים פירמידליים ניתן לראות כאן.

התפלגות חזקה של הצבע הפלואורסצנטי בכל התא מאפשרת ניתוח של דנדריטים וקוצים דנדריטיים בתנאים שונים. עוצמה לטווח ארוך, או LTP, של סינפסות CA3-CA1 של כ 170%, מה שמרמז כי תחזוקה של מפלים איתות הדרושים LTP קיים פרוסות מוכן מעכברים בוגרים. אות פוטנציאלי פוסט-סינפטי חזק של השדה מרמז על כך שגם קישוריות הרשת נשמרה.

שני היבטים קריטיים של הפרוטוקול הם שפע טרנסקרדיאלי עם פתרון קר כקרח כדי לגרום להיפותרמיה והכנסת NMDG כתחליף יון נתרן בפתרונות למניעת בצקת ציטוקסטית. באמצעות אמצעי זהירות אלה, פרוסות חריפות ניתן להכין מכל אזור במוח. יתר על כן, פרוסות שהוכנו באופן זה ניתן להשתמש עבור הדמיה סידן ומתח באמצעות שני פוטון או מיקרוסקופיה שדה רחב.

פרוטוקול זה יכול לשמש בסיס להכנה מתוקקנת לפרוסות היפוקמפוס חריפות מבעלי חיים מזדקנים ובכך להקל על השוואות בין מחקרים בהקשר של מנגנוני מחלה נוירודגנרטיבית.