תרבית ראשונית של תאי אפיתל פיגמנט רשתית חזירית

הפרעות הקשורות ל-RPE נשארות חלק מרכזי במיזוג מחלות, אך ללא שרידים יעילים בתרבית וירטואלית של תאי RPE ראשוניים שישמשו מודל טוב למחקרים פיזיולוגיים ופתולוגיים של הפרעות הקשורות ל-RPE. בפרוטוקול זה, אנו מספקים פרוטוקול קל למעקב לתרבית IPCs ראשוניים, אשר יכול לשחזר במהירות ולשמור על מאפייני RP מאוחרים יותר, אנו מאמינים כי באמצעות שיטה זו אנשים יכולים ליצור במהירות תאי RP ממחקרי macistate ואת הקרנות סמים מגן אשר יכול להקל על פיתוח של טיפול חדש עבור הפרעות RPE. הדגמת ערך צעד אחר צעד תהפוך את השיטה הזו להרבה יותר קלה לשכפול במעבדות שונות שרוצות לחקור תאי RP.

כדי להתחיל להפשיר את אנזים עיכול רקמות malaquad ולעקר 1X PBS. בתוספת 2% פניצילין ו-2% סטרפטומיצין על ידי סינון התמיסה דרך יחידת מסנן מזרק בגודל 0.22 מיקרומטר. לשטוף את הבארות של צלחת תרבית ו transwell מוסיף עם 1X PBS.

הסר את PBS מן הבארות ו transwells עם פיפטה ולהוסיף מיליליטר אחד של 1X PBS טרי לתא התחתון ו 600 מיקרוליטר של 10 מיקרוגרם לכל מיליליטר תמיסת למינין לתא העליון. דגירה של הצלחות ותוספות טרנסוול בחממת הליציקולטורה זו למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, הסר את תמיסת הלמינציה מהתא העליון ושטוף במיליליטר אחד של PBS קר 1X פעמיים לפני שיושבת התא נקה את מכסה המנוע של זרימת הלמינציה עם 75% אתנול ואור UV.

הכינו שלושה צינורות צנטריפוגה סטריליים של 50 מיליליטר המכילים כ-25 מיליליטר של 75% אתנול, שלושה צינורות צנטריפוגה סטריליים של 50 מיליליטר המכילים כ-25 מיליליטר של 1X PBS, ושלושה כלי תרבית תאים סטריליים באורך 10 ס"מ המכילים כ-15 מיליליטר של 1X PBS. השרו ארבעה גלגלי עיניים חזיריים בכ-15 מיליליטר של 75% אתנול בצלחת פטרי באורך 10 ס"מ והשתמשו בזוג מספריים ומלקחיים כדי לנתק את כל שאריות רקמות החיבור והשרירים. כדי לפרק את גלגלי העיניים, השרו ושטפו ארבעה גלגלי עיניים בשלושה צינורות צנטריפוגה סטריליים של 50 מיליליטר מלאים ב-75% אתנול ברצף.

לאחר מכן לשטוף את גלגלי העיניים בשלושה צינורות צנטריפוגה סטריליים 50 מיליליטר מלא 1X PBS ברצף. הפוך את הצינורות כל דקה כדי לשטוף את גלגלי העיניים ביסודיות. העבירו את ארבעת גלגלי העיניים לתוך צלחת תרבית תאים סטרילית באורך 10 ס"מ המכילה PBS 1X.

חתוך שוב את המשטח החיצוני של כל גלגל עיניים, כדי להסיר את עצב הראייה ופסולת קטנה. השתמש מספריים כדי לעשות חתך קטן בצומת של לימבוס וסקלרה. ואז להסיר את הקרנית, הקשתית, העדשה, הגוף הזגוגי והרשתית העצבית.

העבירו את קומפלקס ה-RPE choroid sclera לצלחת תרבית תאים חדשה באורך 10 ס"מ ובצעו ארבעה חיתוכים כדי לנפח את העין לצורת תלתן בעל ארבעה עלים. בצע מסעות בעיכול תמיסות EDTA על ידי הצבת ארבעת מתחמי הסקלרה של RPE choroid לתוך צלחת חדשה בגודל 10 ס"מ ומזיגת 20 מיליליטר של תמיסת טריפסין EDTA טרייה כדי למזג את קומפלקסי הסקלרה הכורואידים של RPE. מכניסים את המנה לחממה של תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כמעט 30 דקות.

לאחר 30 דקות, מוציאים את המנה מהאינקובטור ומוסיפים 20 מיליליטר של מדיה של תרבית תאים חמה מראש עם 10% FBS למנה. כדי לנטרל את הנסיעות בתמיסת EDTA השתמש פיפטה העברה של חמישה מיליליטר כדי לנתק את תאי ה- RPE על ידי פיפטינג עדין מספר פעמים. לאסוף את מתלי התא לתוך צינורות צנטריפוגה 15 מיליליטר, ולאחר מכן בעדינות פיפטה עוד 10 מיליליטר של מדיה תרבית טרי עם FBS לשטוף את RPE Choroids sclera קומפלקסים על המנה.

אסוף את תאי ה-RPE על ידי צנטריפוגה של הצינורות ב-300 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את ה-SuperAgent באמצעות פיפטה והוסיפו עוד חמישה מיליליטרים של מדיית תרבית עם FBS כדי להשעות מחדש את התאים. צנטריפוגה ב 300 גרם במשך חמש דקות נוספות.

לנטרל את SuperAgent ולהשעות מחדש את התאים עם 12 מיליליטר של מדיה תרבית. הזרע הבא 100, 000 עד 200, 000 תאים לכל באר לתוך 12 צלחות תרבית באר או טרנסוול מוסיף. שנה את מדיית התרבית כל יומיים והפחת את ריכוז הסרום ל -1% כאשר התאים מכסים באופן מלא את פני השטח של הבארות בכל תוספת.

שנה את מדיית התרבית כל יומיים עד שהתאים נקטפים. התמונות המייצגות של תאי RPE חזיריים ראשוניים ביום השני, ביום השישי וביום העשירי מוצגות כאן. ניתוח QRTPCR של רמות mRNA של גנים חתימה בתאי RPE חזיריים ראשוניים, תאי RPE אנושיים ראשוניים, תאי ARPE 19 ורקמת כורואיד RPE חזירית מזוהה על ידי תמונה גרפית זו.

כאן GAP DH שימש כגן משק הבית עבור RTPCR. ארבעה שכפולים ביולוגיים שימשו לתאי RPE חזיריים ראשוניים ולתאי RPE 19 שבהם שלושה שכפולים ביולוגיים שימשו לתאי RPE אנושיים ראשוניים ולרקמת כורואיד RPE חזירית. רמות ביטוי הגנים בתאי ARPE 19 הוגדרו כבקרות.

ניתוח הדם המערבי של חלבוני RPE 65 בתאי ARPE 19 ו-RPE חזיריים ובתאי RPE אנושיים ראשוניים וברקמות כורואידיות של RPE חזירי מוצגים באיור זה. וינקולין שימש כאן כבקרת טעינה. נתון זה מציג תרבית של שבועיים של תאי RPE חזיריים במדיה DMEM Basic עם 1% FBS.

תאים בתרבית עם או בלי לאמין הוכתמו ב-RPE 65, נתרן אשלגן APTAs, Z01 והקס. מדידות TR ביריעות תאים, בתרבית עם או בלי למינין מתוארות באיור זה. ניתוח הדם המערבי של גורם גדילה אנדותל וסקולרי או VEGF וגורם אפיתל פיגמנטי נגזר או PEDF בתאי RPE חזיריים ראשוניים ו- ARPE 19 מוצגים באיור זה.

הפונקציות הסקטוריאליות של תאי RPE חזיריים ראשוניים בתרבית ותאי ARPE 19 מוצגות בתמונות אלה. החלק הגדול של פרוטוקול זה הוא להמיס תאי RP ממתחמי גליה של RPE chide. אנו ממליצים להשתמש בנסיעות ותמיסות טריות בכל פעם ולשלוט כראוי בזמן העיכול, כדי להמיס שמונה תאי RP.