Name: הדמיה חיה של אבות לב מוקדמים בעובר העכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: למד הדמיה חיה של עוברי עכברים לחקר קרדיוגנזה מוקדמת ותהליכים דינמיים בהתפתחות עוברית. פרוטוקול זה מספק מדריך ויזואלי מפורט לטכניקות הדמיה מורכבות עבור חוקרים בביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לד"ר קנזו איבנוביץ' על עבודתו הקודמת על שיטה זו ולקבוצתו של ד"ר שיגנורי נונקה (המכונים הלאומיים למדעי הטבע, יפן) על מתן המומחיות הראשונית בהרכבת עוברים. מחקר זה נתמך על ידי Grant PGC2018-096486-B-I00 מ-Ministerio de Ciencia e Innovación הספרדי ומענק H2020-MSCA-ITN-2016-722427 מתוכנית Horizon 2020 של האיחוד האירופי ל-MT ומענק 1380918 מתוכנית ההפעלה FEDER Andalucía 2014-2020 ל-JND. MS נתמכה על ידי מלגת La Caixa Foundation PhD (LCF / BQ / DE18/11670014) ומלגת הנסיעות של חברת הביולוגים (DEVTF181145). CNIC נתמך על ידי משרד המדע הספרדי וקרן ProCNIC.

כל נהלי בעלי החיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של ניסויים בבעלי חיים של CNIC, על ידי קהילת מדריד (סימוכין PROEX 220/15) ותאמו להנחיית האיחוד האירופי 2010/63EU ולהמלצה 2007/526/EC בנוגע להגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות ניסוייות ומדעיות אחרות, שנאכפו בחוק הספרדי תחת צו אמיתי 1201/2005.
פרוטוקול זה כולל שימוש בשני זכרים מקו העכבר המהונדס הפלואורסצנטי המדווחים על פעילות NOTCH Tg(CBF:H2BVenus,+)18. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על חומרים, בעלי חיים וציוד המשמש בפרוטוקול זה.
1. כלים והתאמה אישית של המחזיק
<ol><li>חותכים חתיכות חוט טונגסטן באורך 1 ס"מ ומחדדים אותן לקוטר 0.02-0.05 מ"מ בכל אחת מהשיטות הפשוטות הקיימות, למשל, השקעת קצה החוט בתמיסת נתרן ניטריט רווי19.</li>
	<li>הכינו נימי זכוכית עם מרפקים.<ol><li>מניחים את נקודת האמצע של נימי זכוכית סטנדרטיים בקוטר 1.0 מ"מ מעל מצית בונזן למשך 3-6 שניות, מושכים באיטיות משני הקצוות עד שהנימים הופכים דקים וגמישים. בשלב זה, שברו את הנימים לשניים וחממו אותו לזמן קצר כדי לייצר כיפוף של 90 מעלות 2 ס"מ מהקצה.</li>
	</ol></li>
	<li>ראיתי חתיכת פולימתיל מתקרילט באורך של כ-7 מ"מ, רוחב של 4 מ"מ ועובי של 2 מ"מ (איור 3D). הערה: יריעות פולימתיל מתקרילט ניתן להשיג מציוד מעבדה ממוחזר או להזמין חדש.</li>
	<li>החזיקו את חתיכת המתאקרילט באמצעות ויזת ספסל. לאחר מכן, קדחו חורים בגודל מותאם אישית באופן רוחבי דרך כל היצירה (איור 3D). הערה: בדרך כלל, עוברי עכבר E6.5 עד E7.5 דורשים שימוש במקדחות בקוטר 0.2-0.5 מ"מ.<ol><li>סובב את המקדחה באיטיות תוך הפעלת לחץ נמוך אך קבוע. אם מקדחה נשברת בתוך המחזיק, השליכו את היצירה, מכיוון שלא ניתן להוציא את המתכת.</li>
	</ol></li>
	<li>השתמשו בקובץ עדין כדי להחליק את קצות המחזיק ולהתאים את גודלו. בנוסף, צרו שיפוע מתון בשולי המחזיק כדי להקל על מיקום העובר (איור 3D).</li>
	<li>מניחים את המחזיק המוגמר בכלי עם מים מזוקקים כדי לשטוף אותו.</li>
	<li>בדוק את המחזיק מתחת לסטריאומיקרוסקופ כדי לראות אם החורים מכילים אבק קידוח. אם קיים אבק, השתמש במחטי טונגסטן כדי להסיר אותו.</li>
	<li>כדי לעקר את המחזיק, הניחו אותו בצינור חרוטי מלא במים מזוקקים וניקו אותו למשך 20 דקות עם תפוקת חשמל מינימלית של 20 ואט.</li>
</ol>2. הכנת מדיה
<ol><li>כדי להשבית בחום את מערכת המשלים, השאירו שני עלי 500 מיקרוליטר של סרום 20 חולדות מסחרי או ביתי בטמפרטורה של 56°C למשך30 דקות. הערה: לקבלת פרוטוקול מפורט כיצד להכין נסיוב חולדות, ראה21.</li>
	<li>במכסה מנוע של תרבית תאים, הכינו שני אליציטוטים של המדיום לגידול העוברים במיקרוסקופ. עבור כל אחד מהם, ערבבו 490 μL של DMEM להדמיית תאים חיים, 500 μL של נסיוב חולדות בלתי פעיל ו-10 μL של פניצילין-סטרפטומיצין כדי לקבל ריכוז סופי של 50 מיקרוגרם/מ"ל פניצילין ו-50 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין22. הערה: נפח מדיום התרבית תלוי בזמן ובמספר העוברים שיש לתרבת. ככלל אצבע, גדילה אופטימלית דורשת מינימום של 200 מיקרוליטר לעובר ליום בעוברי E7.0.</li>
	<li>באמצעות מזרק 2 מ"ל, מסננים את התווך דרך מסנן קרום בגודל נקבוביות בגודל 0.22 מיקרומטר לתוך צינור חדש ומניחים אותו פתוח באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37°C ו-7% CO2 למשך שעה אחת לפני תרבית עוברים23.</li>
	<li>הכינו את מדיום הדיסקציה על ידי הוספה ל-500 מ"ל DMEM בתוספת בקבוק L-גלוטמין את הדברים הבאים: 50 מ"ל של סרום בקר עוברי, 10 מ"ל של 25 מ"ל HEPES-NaOH (pH 7.2), ו-10 מ"ל פניצילין וסטרפטומיצין (50 מ"ג/מ"ל).</li>
	<li>לאחר מכן, להפריד אותו לתוך 50 מ"ל aliquots, מניחים שלושה aliquots באמבטיה 37 ° C ולאחסן את השאר ב 4 ° C במשך עד 3 חודשים.</li>
</ol>3. דיסקציה של עוברים
<ol><li>הרדימו עכבר בהריון E6.75-E7.5.</li>
	<li>מוציאים את הרחם ומניחים אותו על מגבון נייר יבש ונקי. לאחר מכן, חותכים את הרחם, מכניסים את קצה המספריים העדינים מהצד המזומטריאלי ומחליקים את הלהב לאורך כדי לחשוף את המספריים ולהעביר אותם למדיום הדיסקציה. לפרוטוקול מפורט, ראה24.</li>
	<li>נתחו את העוברים, תוך שמירה על חרוט השליה האקטושאלי שלם (איור 3A,B). לשיטת דיסקציה מפורטת, עיין בסעיף25.</li>
	<li>לאחר מכן, קלפו את קרום רייכרט, והשאירו חלק ממנו על האזור החוץ-עוברי (איור 3B). הערה: מלקחיים עדינים חיוניים לשלב זה. משתמשים לא מנוסים יכולים לנתח עוברים על כלים מצופים ג'ל אגרוז 2% כדי להימנע מכיפוף קצות המלקחיים כנגד משטח הצלחת (איור 3C).</li>
	<li>כדי לשמור על חום בינוני של הדיסקציה, החליפו אותה כל 10 דקות. יתר על כן, לנתח deciduae בקבוצות של 3-4 תוך שמירה על השאר בינוני דיסקציה ממוקם באמבטיה 37 מעלות צלזיוס. הניחו מיד את העוברים המנותחים במדיום התרבית.</li>
	<li>בחרו את העוברים בעלי התכונות הפלואורסצנטיות הרצויות באמצעות סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי והניחו אותם בצינור המכיל מדיום תרבית באינקובטור תרבית התא.</li>
	<li>אם העוברים נמצאים בשלבי E6.5 עד E7.0, סגרו את המכסה והשאירו את העוברים להתאושש במשך שעתיים לפני ההדמיה. הערה: עוברים E6.5 עד E7.0 הם רגישים. ניתן גם למקם אותם ישירות מתחת למיקרוסקופ, אך הטיפוח מאפשר לבחור את אלה שמתאוששים בצורה הטובה ביותר מדיסקציה, מה שמגדיל את סיכויי ההצלחה.</li>
</ol>4. הכנת מיקרוסקופ
<ol><li>הפעל את כל רכיבי המיקרוסקופ, כולל לייזרים, מחשב ותוכנה. הפעל את בקרי הטמפרטורה והגדר ל- 37 ° C 3 שעות מראש כדי להבטיח איזון.</li>
	<li>אם אתם משתמשים במטרה לזיהוי טבילה, נקו אותה באמצעות מגבון חד פעמי ללא שאריות. טובלים את קצה המטרה במים מזוקקים פעמיים באמצעות צלחת בקוטר 60 מ"מ ומשאירים אותה עד לתחילת הרכישה.</li>
	<li>הפעל את בקר CO2 והגדר אותו ל- 7%.</li>
	<li>הניחו טיפה של שומן סיליקון בוואקום גבוה על צלחת בקוטר 35 מ"מ עם תחתית מכסה זכוכית (קוטר 14 מ"מ), הניחו את המחזיק על גבי הטיפה ולחצו בעדינות כדי לשתק אותו.</li>
	<li>תחת סטריאומיקרוסקופ, הוסיפו מדיום תרבית כדי למלא את החלק התחתון של הזכוכית. תוך כדי כך, כוונו את הזרם אל חורי המחזיק כדי למנוע היווצרות בועות אוויר בהם.</li>
	<li>אם הבועות נשארות, השתמשו בנימי הזכוכית שהוכנו בשלב 1.2, מחוברים לצינור סיליקון עם פייה, כדי למצוץ את הבועות החוצה בעדינות. הערה: קצה המרפק של הנימים יאפשר גישה דרך החורים.</li>
</ol>5. הרכבת עוברים
<ol><li>העברת 2-3 עוברים שנותרו להתאוששות באינקובטור לצלחת עם המחזיק. השאירו את השאר בחממה כגיבוי.</li>
	<li>הניחו את העוברים בחורים באמצעות זוג מלקחיים ומחט טונגסטן מחודדת. השתמש במחט כדי לחבר את העובר על ידי חרוט השליה ולהחדיר אותו לתוך חור תואם גודל. כדי לשתק את העובר, סובבו את החרוט ב-90-120° כך שהקרום של רייכטר ייצמד לדפנות החור (איור 3C). לקבלת תיאור חלופי, ראה26.</li>
	<li>העבירו בזהירות את הצלחת המכילה את העוברים ואת המחזיק לצלחת המיקרוסקופ (איור 3F,G). הערה: אם לא זז ביציבות, העובר יכול לצאת מהמחזיק.</li>
	<li>מנמיכים את המטרה עד להיווצרות מניסקוס נוזלי בממשק הבינוני-אובייקטיבי.</li>
	<li>אתרו את העובר באמצעות האור המועבר מתחת למשקפת המיקרוסקופ והניחו את העובר בפוקוס.</li>
	<li>הרכיבו את תא הדגירה ואטמו אותו סביב המטרה באמצעות סרט הדבקה (איור 3F).</li>
	<li>באמצעות לכידה חיה בתוכנת בקרת המיקרוסקופ, התאם את פלט הלייזר ואת רמות הרווח. הערה: עבור רכישה של שני פוטונים של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) וכתבי Tdtomato, נעשה שימוש ב-30% עוצמת לייזר ב-980 ננומטר ו-70% בעלייה בגלאים שלא עברו סריקה (איור 3G).</li>
	<li>כדי למנוע אידוי, מכסים את המדיום בשמן פרפין על ידי טפטוף איטי על המטרה. הערה: זוהי הנקודה האחרונה שבה ניתן להרכיב עוברים נוספים במחזיק. לאחר כיסוי בשמן פרפין, יש לנקות את המחזיק ולהחליף את המדיום כדי לעשות זאת. לשיטות הרכבה חלופיות ראה27.</li>
</ol>6. רכישת תמונות
<ol><li>הגדר הקלטה בהילוך מהיר. הגדר מרווח זמן של 5-10 דקות עם רווח z של 3-5 מיקרומטר בין ערימות. השאירו חלל ריק מעל ערימת ה-z כדי לצפות את גדילת העובר, מינימום של 50 מיקרומטר, והוסיפו 30 מיקרומטר עבור כל שעה שהרכישה לא תהיה תחת פיקוח.</li>
	<li>אם זמינה, הפעל את אפשרות השמירה האוטומטית כדי לאפשר פיקוח על הרכישה ממחשב אישי כדי לאפשר התאמה של גודל מחסנית z, במידת הצורך, כך שיתאים לתחום העניין שבמוקד.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64273/64273fig03.jpg"> איור 3: כלי הדמיה חיה והגדרה . (A) ניתוח עוברי עכברים בעזרת צלחת מצופה אגרוז מתחת לסטריאומיקרוסקופ. (B) דיאגרמה של השלבים לניתוח עוברי עכברים לצורך הדמיה חיה. (ג) מיקום העובר במחזיק. (ד) עיצוב מחזיק העובר ותכונותיו. (ו) תא אינקובטור סביב מטרת הטבילה. (G) דיאגרמה של ההגדרה הסופית לרכישת קיטועי זמן. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר (A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64273/64273fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<ol><li>Tyser, R. C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+handling+precedes+cardiac+differentiation+to+initiate+the+first+heartbeat%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat.</a> eLife. 5, 17113(2016).</li>
<li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+fields+and+cardiac+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Heart fields and cardiac morphogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750(2014).</li>
<li>Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+lineage+development%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Myocardial lineage development.</a> Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).</li>
<li>Tam, P. P., Parameswaran, M., Kinder, S. J., Weinberger, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+allocation+of+epiblast+cells+to+the+embryonic+heart+and+other+mesodermal+lineages%3A+the+role+of+ingression+and+tissue+movement+during+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation.</a> Development. 124 (9), Cambridge, England. 1631-1642 (1997).</li>
<li>Kinder, S. J., Loebel, D. A. F., Tam, P. P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allocation+and+early+differentiation+of+cardiovascular+progenitors+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Allocation and early differentiation of cardiovascular progenitors in the mouse embryo.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 11 (5), 177-184 (2001).</li>
<li>Lawson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Fate mapping the mouse embryo.</a> International Journal of Developmental Biology. 43 (7), 773-775 (1999).</li>
<li>Ivanovitch, K., Temiño, S., Torres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+heart+tube+development+in+mouse+reveals+alternating+phases+of+cardiac+differentiation+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Live imaging of heart tube development in mouse reveals alternating phases of cardiac differentiation and morphogenesis.</a> eLife. 6, 30668(2017).</li>
<li>Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+deployment+of+cell+lineages+that+form+the+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The deployment of cell lineages that form the mammalian heart.</a> Nature Reviews Cardiology. 15 (11), 705-724 (2018).</li>
<li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).</li>
<li>Meilhac, S. M., Lescroart, F., Blanpain, C. D., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+cell+lineages+that+form+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cardiac cell lineages that form the heart.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (9), 013888(2014).</li>
<li>Sendra, M., Domínguez, J. N., Torres, M., Ocaña, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+complexity+of+early+heart+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Development+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Dissecting the complexity of early heart progenitor cells.</a> Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (1), 5(2022).</li>
<li>McDole, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+toto+imaging+and+reconstruction+of+post-implantation+mouse+development+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In toto imaging and reconstruction of post-implantation mouse development at the single-cell level.</a> Cell. 175 (3), 859-876 (2018).</li>
<li>Saykali, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mesoderm+migration+phenotypes+in+extra-embryonic+and+embryonic+regions+of+the+early+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Distinct mesoderm migration phenotypes in extra-embryonic and embryonic regions of the early mouse embryo.</a> eLife. 8, 42434(2019).</li>
<li>Ichikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+whole+mouse+embryos+during+gastrulation%3A+Migration+analyses+of+epiblast+and+mesodermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Live imaging of whole mouse embryos during gastrulation: Migration analyses of epiblast and mesodermal cells.</a> PLoS ONE. 8 (7), 64506(2013).</li>
<li>Tyser, R. C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomic+characterization+of+a+gastrulating+human+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomic characterization of a gastrulating human embryo.</a> Nature. 600 (7888), 285-289 (2021).</li>
<li>Aguilera-Castrejon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+utero+mouse+embryogenesis+from+pre-gastrulation+to+late+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis.</a> Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).</li>
<li>Yue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((in+toto+live+imaging+of+cardiomyocyte+behaviour+during+mouse+ventricle+chamber+formation+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">in toto live imaging of cardiomyocyte behaviour during mouse ventricle chamber formation at single-cell resolution.</a> Nature Cell Biology. 22 (3), 332-340 (2020).</li>
<li>Nowotschin, S., Xenopoulos, P., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+single-cell+resolution+live+imaging+reporter+of+Notch+signaling+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A bright single-cell resolution live imaging reporter of Notch signaling in the mouse.</a> BMC Developmental Biology. 13 (1), 15(2013).</li>
<li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sharpened+tungsten+needles%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Sharpened tungsten needles.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2012).</li>
<li>Tam, P. P., Snow, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+culture+of+primitive-streak-stage+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">The in vitro culture of primitive-streak-stage mouse embryos.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 59, 131-143 (1980).</li>
<li>Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rat+serum+for+culturing+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of rat serum for culturing mouse embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (4), 5593(2011).</li>
<li>Tam, P. P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postimplantation+mouse+development%3A+Whole+embryo+culture+and+micro-+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Postimplantation mouse development: Whole embryo culture and micro- manipulation.</a> International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).</li>
<li>González Hinojosa, F. Optimización de propiedades fisicoquímicas y medios de cultivo para el cultivo del embrión de ratón ex vivo. Universidad de Jaén. Biología Experimental. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://hdl.handle.net/10953.1/1400">https://hdl.handle.net/10953.1/1400</a> (2021).</li>
<li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Vintersen Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+R+%22Manipulating+the+mouse+embryo%3A+A+laboratory+manual%2C+Fourth+Edition%22">Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual, Fourth Edition</a>. , Cold Harbor Laboratory Press. 814(2014).</li>
<li>Shea, K., Geijsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (2), e160(2006).</li>
<li>Nonaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+mouse+nodal+flow+by+applying+artificial+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Modification of mouse nodal flow by applying artificial flow.</a> Methods in Cell Biology. 91, 287-297 (2009).</li>
<li>Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+postimplantation+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of postimplantation mouse embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (4), 5595(2011).</li>
<li>Crainiciuc, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+immune+landscapes+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Behavioural immune landscapes of inflammation.</a> Nature. 601 (7893), 415-421 (2022).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

אבות הלב המוקדמים מתארגנים בצינור לב פרימיטיבי שמתחיל לפעום בזמן שהוא עדיין נוצר. הבנת האופן שבו תהליך זה מתרחש היא המפתח לאיתור הספקטרום הרחב של מומי לב מולדים לאירועים מורפוגנטיים ספציפיים. לשם כך, הדמיה חיה מציעה הזדמנות לחקור התפתחות עוברית תקינה ופגומית ברזולוציה טמפורלית מוגברת. זה שימושי במיוחד לחקר תאי אב לבביים מוקדמים כשהם עוברים במהירות דרך התנהגויות התמיינות והגירה מרובות7.
מכיוון שאנו יכולים לחקור שלבים עובריים שונים בדגימה אחת, פרוטוקול ההדמיה החיה המוצג כ...

הלב נוצר מוקדם במהלך האמבריוגנזה כדי להתחיל לשאוב חומרים מזינים לעובר כולו, בעוד הוא ממשיך להתפתח1. בעוברי עכברים, יום וחצי לאחר תחילת הגסטרולציה, איבר לב בסיסי מתכנס בקוטב הקדמי 2,3. בשלב הפס המוקדם (ES), אבות הלב באפיבלסט חודרים דרך הפס הפרימיטיבי לשכבה המזודרמלית המתהווה 4,5,6 ומתחילים לנדוד לקוטב הקדמי, שם הם מתמיינים ליצירת צינור הלב הפרימיטיבי. במהלך התהליך הזה, אבות לב מוקדמים עוברים סידור מחדש של תאים, שינוי צורה והתמיינות, בנוסף לנדידה7 (איור 1).
אבות לב מוקדמים משכו חוקרים במשך כמעט מאה שנה בשל יכולתם יוצאת הדופן להבדיל ולבנות איבר פונקציונלי בו זמנית. במהלך שני העשורים האחרונים, ניתוח שבטים ומודלים של נוקאאוט מותנה הראו כי התפתחות לב מוקדמת מסבכת מקורות תאים שונים בתהליך דינמי מאוד 8,9,10. אולם המבנה התלת-ממדי של צינור הלב הפרימיטיבי והאופי הדינמי של המורפוגנזה שלו הופכים אותו למאתגר למחקר (איור 1), ואנו רחוקים מלהבין את מלוא מורכבותו11.
כדי לחקור את התהליכים התאיים הדינמיים האלה, שיטות הדמיה חיה מציעות כעת פירוט חסר תקדים 7,12,13,14. במודל העכבר, גישות חיות היו המפתח לחקר נושאים התפתחותיים שקשה לטפל בהם באמצעות ניתוח סטטי 7,13,15. בעוד תרבית אקס ויו ארוכת טווח ומערכי מיקרוסקופ חזקים מתקדמים במהירות16,17, רק לחוקרים מעטים יש את המומחיות לצלם בהצלחה עוברים חיים. למרות שפרסומים מבוססי נייר מספקים מספיק פרטים טכניים כדי לשחזר ניסויי הדמיה חיים, קשה לתפוס כמה מיומנויות וטריקים ללא דוגמאות חזותיות או סיוע עמית לעמית. כדי להאיץ את תהליך הלמידה הזה ולהפיץ את השימוש בהדמיה חיה בין מעבדות, הרכבנו פרוטוקול וידאו (איור 2) שאוסף את הכישורים הדרושים לביצוע הדמיה חיה על עוברי עכברים מגרדים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64273/64273fig01.jpg"> איור 1: התמיינות מוקדמת של תאי אב לבביים בעובר עכבר מתחילת הגסטרולציה ועד לשלב שקדם להיווצרות צינור הלב הפרימיטיבי. תאי אב לבביים חודרים למזודרם זמן קצר לאחר תחילת הגסטרולציה, נודדים לצד הנגדי של העובר. שלב היום המורפולוגי והיום העוברי (E) כתובים על גבי התרשימים. חצים מקווקווים מתארים את מסלול הנדידה של אבות צינור הלב הפרימיטיביים במהלך הגסטרולציה. נתון זה הותאםמ-11. קיצורים: ES = פס מוקדם; MS = פס אמצעי; EHF = קיפול ראש מוקדם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64273/64273fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64273/64273fig02.jpg"> איור 2: דיאגרמת זרימת עבודה עבור הדמיה חיה של אבות לב מוקדמים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64273/64273fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table><tbody><tr><td>#55 מלקחיים</td><td>דומונט&nbsp;</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>35 מ"מ צלחת עם כיסוי זכוכית תחתון 14 מ"מ קוטר</td><td>מטק</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>שולחן מלחצים 35 מ"מ&nbsp;</td><td>גרנדדו</td><td>מק"ט 8798771617573</td><td></td></tr><tr><td>שפופרות 50 מ"ל</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>מים</td><td></td><td></td><td></td>מזוקקים</tr><tr><td>DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>11966025</td><td>&nbsp; עם L-גלוטמין, ללא גלוקוז, ללא Na Pyruvate</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Invitrogen</td><td>10438-026</td><td></td></tr><tr><td>עכברים טרנסגניים מדווחים פלואורסצנטיים (Tg(CBF:H2BVenus,+)&nbsp;</td><td>JAX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלואורובריט DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>A1896701&nbsp;</td><td>DMEM להדמיית תאים חיים</td></tr><tr><td>גריז סיליקון בוואקום גבוה</td><td>Dow Corning</td><td>Z273554-1EA</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק לחוטים</td><td>Perlen Pressen</td><td>pwb1</td><td></td></tr><tr><td>LSM 780 מיקרוסקופ זקוף</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MaiTai Deepsee לייזר דופק אדום רחוק מכוון ב-980 ננומטר</td><td>ספקטרה-פיזיקה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>גלאים לא נסרקים המצוידים בערכות המסננים ציאן-צהוב (BP450-500/BP520-560), ירוק-אדום (BP500-520/BP570-610) וצהוב-אדום (BP520-560/BP645-710)</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צילום: טבילה במים פי 20 1.0 NA, עבודה למרחקים ארוכים</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr>פיפטות <td></td><td></td><td></td><td>P1000 ו- P200</td></tr><tr><td>שמן פרפין</td><td>Nidacon</td><td>VNI0049</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td> <td>(הריכוז הסופי צריך להיות 50 &mu; גרם/מ"ל פניצילין ו-50 &mu; גרם/מ"ל סטרפטומיצין)</td></tr><tr><td>צלחות פטרי 35 מ"מ x 10 מ"מ</td><td>BD פלקון</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>קצות</td><td></td><td></td><td></td>פיפטה</tr><tr><td>פולימתיל מתאקרילט&nbsp;</td><td></td><td></td><td>בשימוש חוזר מציוד מעבדה ישן</td></tr><tr><td>עובר תרבית סרום עכברוש, חולדות זכרים SPRAGUE DAWLEY RjHan SD</td><td>Janvier Labs</td><td>9979</td><td></td></tr><tr><td>סט קנסות 160 מ"מ</td><td>RS PRO</td><td>541-6933</td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית סטנדרטיים 1.0 מ"מ</td><td>Anima Lab</td><td>&nbsp; 1B100F-3</td><td></td></tr><tr><td>סטרילי 0.22 &mu; m מסנן מזרק</td><td>קורנינג</td><td>431218</td><td></td></tr><tr><td>סטרילי 5 מ"ל מזרק</td><td>פישר מדעי</td><td>15809152</td><td></td></tr><tr><td>מחטי</td><td></td><td></td><td></td>טונגסטן</tr><tr><td>הומוגנייזר קולי (סוניקטור)</td> <td>בנדלין</td><td>BASO_17021</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה חיה של אבות לב מוקדמים בעובר העכבר

Live Imaging of Early Cardiac Progenitors in the Mouse Embryo

השלבים הראשונים של התפתחות הלב מרמזים על שינויים דרסטיים בהתנהגות התאים ובהתמיינותם. בעוד ניתוח של עוברים קבועים מאפשר ללמוד בפירוט שלבים התפתחותיים ספציפיים בתמונת סטילס, הדמיה חיה לוכדת אירועים מורפוגנטיים דינמיים, כגון נדידת תאים, שינויי צורה והתמיינות, על ידי הדמיה של העובר תוך כדי התפתחותו. זה משלים ניתוח קבוע ומרחיב את ההבנה של איך איברים מתפתחים במהלך embryogenesis. למרות יתרונותיה, הדמיה חיה משמשת לעתים רחוקות במודלים של עכברים בגלל האתגרים הטכניים שלה. עוברי עכבר מוקדמים רגישים כאשר הם מתורבתים ex vivo ודורשים טיפול יעיל. כדי להקל על שימוש נרחב יותר בדימות חי במחקר התפתחותי של עכברים, מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט למיקרוסקופ חי של שני פוטונים המאפשר רכישה ארוכת טווח בעוברי עכברים. בנוסף לפרוטוקול, ניתנים טיפים על טיפול בעוברים ואופטימיזציה של תרבית. זה יעזור להבין אירועי מפתח באורגנוגנזה מוקדמת של עכברים, וישפר את ההבנה של ביולוגיה של אבות לב וכלי דם.

השתמשנו בפרוטוקול כדי להמחיש את הפעלת איתות NOTCH באבות לב מוקדמים העומדים להתמיין לתאי אנדותל במהלך מורפוגנזה פרימיטיבית של צינור הלב. לשם כך, חצינו עכברי בר מסוג C57BL/6-N עם עכברי Tg (CBF:H2BVenus,+)18 כדי להשיג עוברים המדווחים על פעילות NOTCH באמצעות חלבון פלואורסצנטי צהוב נוגה. ב-E7.5, פלואורסצנטיות של ונוס קיימת בכל האקטודרם העצבי, עם כמה גרעינים חיוביים במזודרם הספלנצ'ני והחוץ-עוברי. לאחר 4 שעות, אבות אנדותל מפעילים את ונוס ומתכנסים ליצירת צינור הלב ואבי העורקים שמתחתיו, שהופכים למבנים סגור...

אנו מציגים פרוטוקול מפורט לתרבית והדמיית עוברי עכבר המאפשר הדמיה תלת ממדית + זמן של תאי אב לבביים. ערכת כלי וידאו זו מתייחסת למיומנויות המפתח הנדרשות להדמיה חיה מוצלחת שאחרת קשה לרכוש מפרסומים של טקסט בלבד.

The first steps of heart development imply drastic changes in cell behavior and differentiation. While analysis of fixed embryos allows studying in detail ...

פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של עוברי עכברים תוך כדי התפתחותם. זה מאפשר ללמוד קרדיוגנזה מוקדמת בפירוט. בדומה לצילום תמונות סטילס של עוברים מזויפים, הדמיה חיה מעניקה גישה מלאה לחקר תהליכים דינמיים בהתפתחות עוברים.קשה להבין את הכישורים הנדרשים להדמיית חיים מפרסום טקסט בלבד. לראות אדם אחר עושה את זה הוא חיוני ללמוד. כדי להתחיל, לחתוך חתיכות חוט טונגסטן באורך סנטימטר אחד ולחדד אותם לקוטר 0.02 עד 0.05 מ"מ על ידי השקעת קצה החוט בתמיסת נתרן חנקתי רווי.כדי להכין נימי זכוכית במרפקים, הניחו את נקודת האמצע של נימי זכוכית סטנדרטיים של מילימטר אחד מעל מצית בונזן למשך שלוש עד שש שניות, ומשכו באיטיות משני הקצוות עד שהנימים הופכים דקים וגמישים. לאחר מכן, שברו את הנימים לשניים וחממו אותו לזמן קצר כדי לייצר כיפוף של 90 מעלות שני סנטימטרים מהקצה. ראה חתיכת פולימתיל מתקרילט באורך של כשבעה מילימטרים, רוחב של ארבעה מילימטרים ועובי של שני מילימטרים.החזיקו את חתיכת המתאקרילט באמצעות ספסל ספסל, ואז קדחו חורים מותאמים אישית לרוחב דרך כל היצירה. סובב את המקדחה באיטיות תוך הפעלת לחץ נמוך אך קבוע. השתמשו בקובץ עדין כדי להחליק את קצה המחזיק ולהתאים את גודלו.בנוסף, צרו שיפוע מתון בשולי המחזיק כדי להקל על מיקום העובר. מניחים את המחזיק המוגמר בכלי עם מים מזוקקים כדי לשטוף אותו. תחת מיקרוסקופ סטריאו, בדוק את המחזיק כדי לראות אם החורים מכילים אבק קידוח.אם קיים אבק, השתמש במחטי טונגסטן כדי להסיר אותו. כדי לעקר את המחזיק, הניחו אותו בצינור חרוטי מלא במים מזוקקים וסוניקו למשך 20 דקות עם תפוקת חשמל מינימלית של 20 וואט. לחלץ את הרחם מתוך יום עוברי המתת חסד 6.75 עד 7.5 עכבר בהריון ולהניח אותו על מגבון נייר יבש ונקי.לאחר מכן, חותכים את הרחם, מכניסים את קצה המספריים העדינים מהצד המזום, ומחליקים את הלהב לאורך כדי לחשוף את הדיסקציה, ומעבירים אותם למדיום הדיסקציה. לנתח את העוברים, שמירה על חרוט ectoplacental שלם. לאחר מכן, מקלפים את קרום רייכטר, ומשאירים חלק ממנו על האזור העוברי הנוסף.כדי לשמור על חום בינוני, החליפו אותו כל 10 דקות. יתר על כן, לנתח decidui בקבוצות של שלושה עד ארבעה תוך שמירה על השאר במדיום דיסקציה ממוקם באמבטיה 37 מעלות צלזיוס. הניחו מיד את העוברים המנותחים במדיום תרבית.בחר את העוברים עם התכונות הפלואורסצנטיות הרצויות באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי והנח אותם בצינור המכיל את מדיום התרבית באינקובטור תרבית התא כדי להתאושש במשך שעתיים לפני ההדמיה. לאחר הפעלת כל רכיבי המיקרוסקופ, כולל מחשב, תוכנה ולייזרים, הפעילו את בקר הפחמן הדו-חמצני והגדירו אותו ל-7%, הניחו טיפת שומן סיליקון בוואקום גבוה על צלחת 35 מ"מ עם תחתית כיסוי זכוכית. הניחו את המחזיק על גבי הטיפה ולחצו בעדינות כדי לשתק אותו.להרכבת עוברים יש להעביר שניים עד שלושה עוברים מהאינקובטור לצלחת עם מחזיק. בעזרת זוג מלקחיים ומחט טונגסטן מחודדת, הניחו את העוברים בחורים. השתמש במחט כדי לחבר את העובר על ידי חרוט ectoplacental ולהכניס אותו לתוך חור תואם גודל.בזהירות להעביר את הכלים המכילים את העוברים ואת המחזיק אל צלחת המיקרוסקופ. מנמיכים את המטרה עד להיווצרות מניסקוס נוזלי בממשק האובייקטיבי הבינוני. לאחר הנחת העובר בפוקוס, הרכיבו את תא הדגירה ואטמו אותו סביב המטרה באמצעות סרט הדבקה.באמצעות לכידה חיה בתוכנת בקרת המיקרוסקופ, התאם את תפוקת הלייזר ואת רמות הרווח. לאחר מכן, מכסים את המדיום בשמן פרפין על ידי טפטוף איטי על המטרה. הגדר הקלטת קיטועי זמן.הגדר מרווח של חמש עד 10 דקות עם מרווח Z של שלושה עד חמישה מיקרון בין הערימות. השאירו חלל ריק מעל Z-Stack כדי לצפות את גדילת העוברים. מינימום 50 מיקרון, הוספת 30 מיקרון לכל שעה שהרכישה לא תהיה מפוקחת.הפעל את אפשרות השמירה האוטומטית כדי לאפשר פיקוח על הרכישה ממחשב כדי לאפשר התאמה של גודל Z-Stack במידת הצורך, כך שיתאים לתחום העניין שבפוקוס. התפתחות לב עובר חי בכל הגוף על ידי הדמיית מולטיפוטון מוצגת. ביום העוברי 7.5, פלואורסצנטיות ורידית קיימת בכל האקטודרם העצבי, עם כמה גרעינים חיוביים במזודרם הספלנצ'ני והעוברי הנוסף.לאחר ארבע שעות, אבות אנדותל מפעילים ורידי ומתכנסים ליצירת צינור אנדוקר ואבי העורקים התחתון, אשר הופכים למבנים סגורים לאחר שבע שעות. היזהרו בעת הסרת קרום הרייכטר. זה יכול להיות ממש דבוק לעובר, במיוחד בשלבים prevacillation.במהלך ההסרה, נסה לצבוט את הקרום על ידי האזור העוברי הנוסף.

live-imaging-of-early-cardiac-progenitors-in-the-mouse-embryo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

הסרטון הנוכחי מדגים שיטה אשר מנצל שילוב של electroporation ו מיקרוסקופיה confocal לבצע הדמיה לחיות על הפרט ובתאים עצבית forebrain דג הזברה מתפתח.

זמן לשגות הדמיה חיה של Related Clonally ובתאים עצבית של פיתוח דג הזברה forebrain

הרקמה העוברית הדמיה בזמן אמת הוא מאתגר לאורך תקופות זמן ארוכות. כאן אנו מציגים assay לניטור שינויים הסלולר משנה הסלולר בחוט השדרה חומוס לתקופות ארוכות עם רזולוציה גבוהה במרחב ובזמן. טכניקה זו יכולה להיות מותאם לאזורים אחרים של מערכת העצבים בעובר המתפתח.

ברזולוציה גבוהה הדמיה חיה של התנהגות התא ב Neuroepithelium פיתוח

מוות עובר ולידה הוא תכונה נפוצה כאשר לומדים שינויים גנטיים המשפיעים על התפתחות לב. הדמית אולטרסאונד בתדר גבוה השתפרה רזולוצית 2-D ויכולה לספק מידע מצוין על התפתחות מוקדמת ולב היא שיטה אידיאלית כדי לזהות את ההשפעה על מבנה ותפקוד לב לפני המוות.

אקו העוברי Murine

מיטוזה העצבית היא פרמטר קריטי הנוירוגנזה. חלק גדול מההבנה של מיטוזה העצבית שלנו מבוסס על ניתוח של רקמה קבועה. הדמיה בשידור חי בפרוסות מוח עובריים היא טכניקה צדדי כדי להעריך מיטוזה עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה בסביבה מבוקרת.

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

אנו מתארים סדרה של שיטות להזריק צבעים, וקטורי DNA, וירוסים, ותאים במטרה לעקוב אחר שני גורל התא והפנוטיפ של תאי אנדוגני והמורכבים שמקורם בתאים עובריים או pluripotent בעוברי עכברים ביום עוברי (E) 9.5 ושלבים מאוחרים יותר של פיתוח.

תיוג תא והזרקה בפיתוח לבבות עכבר עוברי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להזריק סוכני אולטרסאונד ניגוד microbubble לחיים, עוברים עכברי שלב מאוחר-הריון מבודד. שיטה זו מאפשרת הלימוד של פרמטרים זלוף ושל סמנים מולקולריים של כלי דם בתוך העובר באמצעות הדמיה אולטרסאונד בתדר גבוה חומר ניגוד.

הדמיה ניגודיות בעכבר עוברים באמצעות תדר גבוהים אולטראסאונד

מוטציות המובילות למומי לב מולדים מפיקות תועלת מחקירה in vivo של מבנה הלב במהלך ההתפתחות, אך מחקרים מבניים ברזולוציה גבוהה בלב העוברי של העכבר הם מאתגרים מבחינה טכנית. כאן אנו מציגים שיטת אימונופלואורסצנציה וניתוח תמונה חזקה להערכת מבנים ספציפיים לקרדיומיוציטים בלב העכבר המתפתח.

ניתוח של Cardiomyocyte פיתוח באמצעות Immunofluorescence בלב העכבר עוברי

אנו מתארים פרוטוקול להדמיה נפחית של תאים המסומנים בחלבון פלואורסצנטי עמוק בתוך לבבות עובריים שלמים ולאחר לידה. תוך שימוש בשיטות ניקוי רקמות בשילוב עם צביעה שלמה, ניתן לדמות תאים בודדים עם תווית חלבון פלואורסצנטי בתוך לב עוברי או לאחר לידה בצורה ברורה ומדויקת.

הדמיה הותרה עוברית ולבבות אחרי לידה ברזולוצית תא בודד

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור כל הר immunofluorescence וניתוח מבוססת תמונה כמותית volumetric העובר העכבר בשלב מוקדם. אנו מציגים טכניקה זו כמו בגישה רב-עוצמה איכותית באופן כמותי להעריך מבנים לב במהלך הפיתוח, ואני מציע כי ייתכן נרחב יכולת הסתגלות למערכות איברים אחרים.

ניתוח כמותי Immunofluorescence כולה-הר של אוכלוסיות לב ב העכבר עוברי

בשיטה זו, רקמות הלב עובריים הם בניתוח microdissected, חלופה מועדפת, הנקרא fluorescently, מושתל לתוך רקמות עובריים המארח. זה מספק פלטפורמה לומד הפרט או רקמות ברמה התפתחותית הארגון תחת תנאים והמודינמיקה חוץ רחמי, ו/או שינו סביבות paracrine/juxtacrine.

Microinjection-מערכת מבוססת עבור-Vivo השרשת Cardiomyocytes עובריים בתוך העובר העופות

אנו מציגים את הפרוטוקולים לבחון התפתחות הלב העכבר באמצעות מיקרוסקופ פלורסנטי הר שלם על העכבר עוברי גזור מן חדרית ספציפי MLC-2v-tdTomato כתב טוק-אין עכברים. שיטה זו מאפשרת לנו לבצע בכל שלב של היווצרות חדרית במהלך התפתחות הלב העכבר מבלי מהגידולים שיטות מעבדה הומנית.

ניתוח התפתחות קאמרית הלב במהלך מופרה העכבר באמצעות כל הר Epifluorescence

למד הדמיה חיה של עוברי עכברים לחקר קרדיוגנזה מוקדמת ותהליכים דינמיים בהתפתחות עוברית. פרוטוקול זה מספק מדריך ויזואלי מפורט לטכניקות הדמיה מורכבות עבור חוקרים בביולוגיה התפתחותית.

הדמיה חיה של אבות לב מוקדמים בעובר העכבר

גלה סרטונים נוספים