הערכה של בריאות המיטוכונדריה בפיברובלסטים הקשורים לסרטן שבודדו מספרואידים של גידולי ריאה רב-תאיים תלת-ממדיים

פרוטוקול זה מדגיש את החשיבות של מיקרו-סביבה של הגידול בהפעלת הפיברובלסטים הקשורים לסרטן או CAF. זה יכול להיות מודל חוץ גופי מצוין לחקור מאפיינים פנוטיפיים. האילוצים העיקריים בביולוגיה של CAF טמונים בזמינות המוגבלת של CAF מדגימות ביופסיה ראשוניות של גידולים.

אז טכניקה זו יכולה לשמש כדי ללמוד היבטים שונים של ביולוגיה CAF. מחקר זה מתאר ייצור צולב חריג ותפקוד לקוי של המיטוכונדריה הקשורים להפעלת CAF המובילה לפרוגנוזה גרועה של הגידול. היישום של שיטה זו יהיה שימושי להערכת אינטראקציות הטראומה של הגידול, במיוחד הפעלת CAF ובריאות המיטוכונדריה.

על מנת לחקור את מטרות הסמים החדשות. אנשים חייבים להיות בעלי ניסיון בהליך התא לפני ביצוע טכניקה זו. ההדגמה החזותית של טכניקה זו תאפשר להבין את השלבים הקריטיים בבידוד אוכלוסיית CAF מהספרואידים של הגידול ומיישומים במורד הזרם כדי לחקור ביולוגיה של CAF.

מיס לינה ארורה, מיס מוינה קליה וגברת סומיאג'יט רוי, עוזרות המעבדה שלי מבצעות את הניסויים. כדי להתחיל לגדל אדנוקרצינומה ריאה אנושית A549 ופיברובלסט ריאה אנושית MRC-5 תאים דבקים בתאי DMEM ומונוציטים אנושיים THP-1 ב- RPMI מדיום גידול מלא ב- T25 צלוחיות ב 37 מעלות צלזיוס בחדר לח עם 5% פחמן דו חמצני.

לאחר שלושה ימים, במפגש של 80% עד 85%, יש לשטוף את תאי A549 ו-MRC-5 במיליליטר אחד של PBS למשך דקה אחת. לאחר מכן, לקצור את התאים על ידי דגירה אותם עם 500 microliters של 0.25% טריפסין EDTA פתרון במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מיד להוסיף ארבעה מיליליטר של מדיום צמיחה מלא כדי להשבית את טריפסין.

לאסוף את מתלה התא לתוך צינור 15 מיליליטר ו לזרוק אותו למטה ב 125 x גרם במשך חמש דקות. הסר את supernatant ו להחיות את התאים במדיום צמיחה שלם של חמישה מיליליטר. כדי ליצור ספרואידים של גידולים רב-תאיים, יש לספור את מספרי התאים A549, MRC-5 ו-THP-1 באמצעות מונה תאים לנפח מיליליטר אחד.

לאחר הספירה, הכן את השעיית התא ביחס של 5:4:1 והרכיב את הנפח למיליליטר אחד עם DMEM מלא. לאחר מכן, הניחו טיפה של 25 מיקרוליטר של תערובת תרחיף תאים על כיסוי של צלחת תרבית של 90 מילימטר. ממלאים את תחתית המנה ב -10 מיליליטר מים סטריליים.

הופכים בזהירות את המכסה מעל תא הלחות המלא במים ומניחים את התבשיל באינקובטור של תרבית תאים למשך שלושה ימים. ביום הרביעי, עקוב אחר הספרואידים מתחת למיקרוסקופ. כדי להשיג תמונות, הפעל את מתג ההפעלה.

הניחו את צלחת התרבית של 90 מילימטר על הבמה ובחרו את ההגדלה של 10 x. התאימו את העדשות ובחנו את התאים כדי לנתח את צבירת התאים והתפשטותם. לחץ על כפתורי ההקפאה והשמירה שסופקו כדי ללכוד את התמונה.

לאחר ההדמיה, החלף את מדיום הצמיחה על ידי שאיפה זהירה של 20 מיקרוליטר של בינוני מכל טיפה עם מדיום טרי. עבור הדמיה חיה מתה, הפעל את Ctr מתקדם, שהוא מתג אחד, ולאחר מכן את המעבד והמתן עד שמערכת התוכנה תאתחל. בעת האתחול, הניחו את צלחת 90 המילימטר המכילה ספרואידים על הבמה של מיקרוסקופ פלואורסצנט הפוך.

לאחר מכן התבונן ולכוד תמונות בהגדלה של 10 x על ידי בחירת אפשרות הפלואורסצנציה בתוכנה ובחירת ה- FITC עבור ערוץ calcein ו- Texas Red. לאחר מכן, בחר את האפשרות, לחיות ולהציג את התמונה. התאימו את עוצמת הפלואורסצנטיות לאופטימיזציה מתאימה ולחצו על כפתור הבטיחות.

לאסוף 200 גידולים, spheroids כל אחד ביום 7 ו 10 באמצעות פיפטה מיליליטר אחד צינור 15 מיליליטר. לאחר מכן גלו את הספרואידים על ידי צנטריפוגה ב 125 x g במשך חמש דקות בזהירות לשאוף את supernatant. לשטוף את הספרואידים עם 200 microliters של PBS, צנטריפוגה שוב להשליך את supernatant.

יש להוסיף 400 מיקרוליטרים של תמיסת EDTA טריפסין 0.25% להתפוררות ספרואידים ולדגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. בצע פיפטינג נמרץ להתפוררות מוחלטת של הספרואידים. נטרול הטריפסין על ידי הוספת מיליליטר אחד של מדיום גידול DMEM מלא.

לאחר מכן צנטריפוגה של מתלה הספרואידים והשלכת הסופר-נאטנט לפני החייאת הכדור במיליליטר אחד של מדיום DMEM שלם. ספור את המספר הכולל של התאים כפי שהוכח. לבידוד של פיברובלסטים הקשורים לסרטן או CAFs מהספרואידים של הגידול, יש להשעות 1 x 10 לתאים השביעיים ב-80 מיקרוליטרים של מיון תאים פעילים מגנטיים קרים או חיץ MACS.

הוסיפו 20 מיקרוליטרים של מיקרובים אנטי-פיברובלסטים לתוך תרחיף התאים, ערבבו היטב על ידי הקשה עדינה על הצינור והדגירה שלו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים עם מיליליטר אחד של חיץ MACS קר. לאחר מכן צנטריפוגה ושאיפה של supernatant לפני החייאת הכדור ב 500 microliters של מאגר MACS.

להפרדת תאים מבוססת חרוזים מגנטיים, הכינו את עמודת ה-MACS על ידי שטיפתה בשלושה מיליליטרים של מאגר MACS. הנח את מתלה התא לתוך העמודה ואסוף את הזרימה דרך המכיל את אוכלוסיית התאים ללא תווית. לאחר מכן, לשטוף את העמודה שלוש פעמים עם שלושה מיליליטר של חיץ MACS לפני הסרת אותו מן המפריד.

לאחר מכן הניחו את העמודה על צינור האיסוף. אסוף את התאים המסומנים במיקרובלד נגד פיברובלסטים על ידי הוספת חמישה מיליליטר של חיץ MACS ודחיפת הבוכנה בחוזקה לתוך העמודה. צנטריפוגה של התאים המסומנים לפני שתמשיך ליישומים במורד הזרם.

לספור את מספר CAFs מבודדים ולהשתמש כ 6 x 10 לתאים הרביעי לניתוח ציטומטריה זרימה. לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS, ולאחר מכן צנטריפוגה ולשאוף supernatant. לאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של חיץ חלחול תאים ודגרו את התאים בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם מערבולת לסירוגין כדי לשמור על תרחיף של תא בודד.

שוב, לאחר צנטריפוגה והחייאת התאים במאגר חלחול, הוסיפו שני מיקרוליטרים של נוגדן אלפא SMA מצומד APC ודגירה בארבע מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. לאחר הדגירה, להוסיף מיליליטר אחד של חיץ permeabilization צנטריפוגה כדי להסיר נוגדנים עודפים. השהה את הכדור ב-400 מיקרוליטרים של חיץ חדירות עבור ציטומטריה של זרימה.

בחר תאים חיוביים של ACTA2 לאחר הבחנה בין אוכלוסיות התאים בהתבסס על הפיזור הקדמי והצדדי שלהם. בחירת אוכלוסיית הסינגלט ואחריה בחירת התאים החיוביים ACTA2 המופיעים כשיא יחיד בהיסטוגרמה של פרמטר יחיד. התפתחות של ספרואידים של גידולים רב-תאיים ואנליזה של מתים חיים מוצגים כאן.

ביום השביעי, הספרואידים היו קומפקטיים וקשיחים בקוטר של כ-260 מיקרון. ביום העשירי, הספרואידים היו בקוטר של 480 מיקרון. בבדיקת הכדאיות של התאים נצפתה ירידה בפלואורסצנציה של פרופידיום יודיד ועלייה בפלואורסצנציה של קלצין-AM מהיום השביעי ליום העשירי.

צביעה היפוקסית גילתה ליבה היפוקסית במרכז היום 10 ספרואידים. יתר על כן, נצפתה עלייה בוויסות של ביטוי גנים E-cadherin ו- Mki-67 עם העלייה בימים של היווצרות ספרואידים סרטניים. CAFs שבודדו מהספרואידים של הגידול ביום 10 היו חיוביים בכ-69% ACTA2.

ה-CAFs הראו עלייה של פי שלושה ב-ACTA2 ופי עשרה בשרשרת קולגן מסוג 1 אלפא 2 בהשוואה לפיברובלסטים של MRC-5. נצפתה עלייה משמעותית ברמות ROS ביום 10 של ספרואידים סרטניים בהשוואה ליום השביעי, מה שמרמז על מעורבות אפשרית של יצירת ROS בהפעלת CAF. עלייה משמעותית נצפתה ברמות ROS תאיות ב-CAFs, שבודדו מהיום השביעי ומהיום העשירי של גידול הספרואידים.

יתר על כן, שינוי בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית נצפה על ידי צביעת JC-1. אינדוקציה של ביטוי גנים GLUT1 ו-MCT4 נצפתה ב-CAFs בהשוואה לפיברובלסטים רגילים. אינדוקציה משמעותית של לקטט דהידרוגנאז, ציטוכרום C אוקסידאז ופעילות אנזים סוקצינאט דהידרוגנאז נצפתה ב-CAFs בהשוואה לפיברובלסטים רגילים.

יש להשתמש ביחס של 5:4:1 של תאי A549, MRC-5 ו-THP-1 להתפתחות מוצלחת של ספרואיד גידול רב-תאי תלת-ממדי. אוכלוסיית הפיברובלסטים היא קריטית לנוקשות הספירואידים של הגידול. בדומה לתמיסת קטיון ואפיון, ניתן גם להשתמש בספרואיד הגידול הזה כדי להשיג אוכלוסיית תאי מקרופאגים הקשורה לגידול, שהיא שותפה להתקדמות הגידול.

ניתוח ספרואידי זה יעזור לנו להבין כיצד תאים סרטניים שחצו פיברובלסטים מעורבים בהפעלת ה-CAFs, וניתן להשתמש בו גם כדי לבדוק את המועמדים לתרופות ספציפיות למיטוכונדריה.