העשרת תרביות נוירונים של גרעיני שורש גבי של עכבר בוגר על ידי אימונופנינג

פרוטוקול זה מאפשר לנו לשפר את מספר תאי העצב בתרביות גרעיני שורש גביים של עכברים בוגרים. זה עשוי לעזור לקבוע את התרומה של תאים עצביים לתגובה נתונה. הוספנו שלב אימונופנינג לפרוטוקול תרבית DRG בסיסי.

היתרון העיקרי הוא לבחור נגד תאים שאינם עצביים. אם אתה חדש בתרבויות DRG ראשוניות, עדיף לתרגל דיסקציות כדי לקבל כמה שיותר DRGs, ולקצץ כמה שיותר מהעצב. כדי להתחיל, שואפים את פולי-D-ליזין המשמש לציפוי צלחת התרבית, ולשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם מים תרבית רקמות.

הטו את המכסה פתוח ואפשרו למשטח להתייבש לחלוטין. מרחו מספיק למינין על הצלחת כדי לצפות את תחתית כל באר, והניחו אותו באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. שטפו את כלי הגלילה שהוכנו בעבר של CD45, PDGFR-beta ו-O4 עם D-PBS.

עבור צלחת CD45, להוסיף 5 מיליליטר של 0.2% BSA ו 20 מיקרוליטר של נוגדן CD45 ראשוני. עבור צלחת PDGFR-beta, יש להוסיף 15.2 מיקרוליטר של PDGFR-beta לצלחת המכילה 0.2% BSA. עבור צלחת O4, הוסף 2 מיליליטר של O4 hybridoma ל 3 מיליליטר של 0.2% BSA, ועוד 100 מיקרוליטר של 4% BSA, כדי להבטיח את ריכוז BSA הסופי נשאר על 0.2% לאחר מכן, לחורר את העכבר עם 30 מיליליטר של 0.9% מלוחים קרים כקרח.

שימו לב לשינוי בצבע הכבד כדי להבטיח זילוח. הצמד את הכפות הקדמיות והאחוריות לשלב קלקר, והשתמש בסכין גילוח נקי כדי לחשוף את עמוד השדרה מאחור. בצע כריתת למינקטומיה על ידי ביצוע חתכים בערך באמצע הדרך משני צדי עמוד השדרה הגבי, הסרת החצי הגבי של העמוד כדי לחשוף את חוט השדרה.

או לחתוך בעדינות את העצבים ולהסיר את חוט השדרה, או בעדינות לדחוף את החוט הצידה, שמירה על שלמות העצבים. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמש בשורשי עצב עמוד השדרה כדי למצוא ולהסיר את כל גרעיני השורש הגבי, או DRGs, משני צדי עמוד השדרה. חתוך את פסולת העצבים מכל DRG כאשר הוא מוסר, שכן יותר פסולת עצבית בתרבית עלולה להוביל להישרדות ירודה.

אספו את ה-DRGs ב-15 מיליליטר HBSS בצינור חרוטי על קרח, ואפשרו להם לשקוע לקרקעית. באמצעות פיפטה, לשאוב את רוב HBSS מן DRGs, ולהשאיר כ 100 מיקרוליטר של נוזל בצינור, כדי למנוע לאבד את הרקמה. שטפו שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של HBSS, והוסיפו 5 מיליליטר של תמיסת STEMxyme עובדת שהופשרה בעבר לרקמה.

מכסים את המכסה בסרט שקוף, וצפים את הצינור על צדו באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס, למשך שעה. לאחר הדגירה עם האנזים, להוסיף 1 מיליליטר של תמיסת מעכב ovomucoid נמוך לצינור. שלשו את התאים בעדינות עם פיפטה P1000 10 עד 15 פעמים, ואפשרו לגושי הרקמה להתיישב.

לאחר מכן מעבירים את 2 עד 3 המיליליטר העליונים של התמיסה המכילה תאים מנותקים לתמיסת אובומוקואיד נמוכה טרייה, וחוזרים על הפעולה עד שהרקמה מנותקת לחלוטין, ולא נשארים גושים נראים לעין. צנטריפוגה את הצינור במשך 10 דקות ב 300 x גרם בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת הסופרנאטנט באמצעות פיפטה, כפי שהודגם קודם לכן, יש להשהות מחדש את כדורית התא במיליליטר אחד של חיץ גלילה, ולערבב פיפטה בעדינות.

הרטיבו מראש מסננת תאים של 70 מיקרומטר עם חיץ גלילה של 1 מיליליטר מעל צינור חרוטי של 50 מיליליטר, ולאחר מכן סננו את תמיסת התא דרך מסננת התא. לשטוף את הצינור עם 1 מיליליטר של חיץ panning, ולהעביר אותו דרך מסננת. לשכבות תאים, הוסיפו 2 מיליליטר של 15% BSA וציפו בעדינות את דפנות הצינור הסגור.

כדי להסיר את פסולת המיאלין, שכב בזהירות את תרחיף התא מיליליטר אחד בכל פעם על ידי pipetting על הצד של הצינור, על גבי כרית BSA. צנטריפוגה את הצינור ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, עם האצה איטית והאטה. שכבת המיאלין האמצעית מראה פתיתים של חומר לבן.

באמצעות פיפטה P1000, להסיר את הנוזל השקוף על גבי, את שלב המיאלין שביניהם, ואת BSA, מיליליטר אחד בכל פעם, משאיר כ 100 מיקרוליטר כדי לא להפריע את הכדור. לשליפת אנטיגן, הוסיפו 5 מיליליטר של חיץ פנורמי ודגרו על הצינור באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ו-10% פחמן דו חמצני למשך 30 עד 45 דקות. לאחר מכן, לשטוף את צלחת CD45 מודגר שלוש פעמים עם D-PBS, ויוצקים את השטיפה הסופית.

לאחר מכן יוצקים את השעיית התא לתוך צלחת CD45. לדגור על המנה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, לערבל בעדינות במרווחים של 10 דקות כדי לאפשר לתאים לקבל גישה שווה לנוגדן. נערו בעדינות את צלחת CD45 והעמידו אותה בזווית.

בזהירות פיפטה 1 מיליליטר של תרחיף התא מעל המנה, כדי לאסוף תאים לא קשורים. לאחר מכן העבירו אותו לצלחת PDGFR-beta, שנשטפה בעבר שלוש פעמים עם D-PBS, ודגירה. מעבירים את התאים הלא קשורים מצלחת PDGFR-beta לצלחת O4, כפי שהודגם קודם לכן, ודורים על הצלחת.

לאחר הדגירה, להעביר את השעיה התא צינור חרוטי 15 מיליליטר צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות. משעים מחדש את התאים בנפח הרצוי, ומדללים ליחס של 1:1 עם כחול טריפאן לקיום התא. באמצעות המוציטומטר, לספור את התאים בינוניים עד גדולים.

מוציאים את הלמינין ומיד לוחצים את התאים בצפיפות הרצויה, מבלי לאפשר להם להתייבש לפני הדגירה על הצלחת. תרביות ה-DRG הקבועות, השלמות והאימונופוניות הוכתמו בבטא3-טובולין עבור תאי עצב ו-DAPI עבור כל הגרעינים. בתרביות DRG שלמות נקבע צביעה של כ-42.36% בטא3-טובולין, ובתרביות DRG מדומוניות נקבע צביעה של כ-71.44% בטא3-טובולין, מה שחושף עלייה משמעותית בהעשרה העצבית עם אימונופנינג.

טיפול ברקמה בזהירות הוא מאוד חשוב. טיפול עדין ב- DRGs, חיתוך עצב עודף, וזהירות לא להתסיס או לאבד רקמות ותרבית הם כולם חיוניים להיות מודעים.