יצירת אורגנואידים של כלי דם אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים

פרוטוקול זה מתאר את הדור שלנו של אורגנואידים של כלי דם אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטים. טכנולוגיה זו יכולה לשמש לחקר היבטים של כלי דם, אנגיוגנזה, מחלות כלי דם, כמו גם פתולוגיות של כלי הדם. יכולת השחזור ואופי התפוקה הגבוהה, כמו גם העקביות שלה על פני קווי תאי גזע רבים ושונים, הם יתרונות חזקים של טכניקה זו.

מבחינת היישום שלהם, חלק מהמחקרים הקודמים שלנו מתארים את השימוש באורגנואידים של כלי דם כדי לחקור את השינויים המורפולוגיים עבור כלי הדם של חולי סוכרת ובוחנים דרכים לטיפול תרופתי בכלי דם סוכרתיים. שמירה נכונה על אוכלוסיית תאי הגזע הראשונית, מניעת הצטברות האגרגטים והבטחת קוטר מצרפי כמעט הומוגני, אלה הם גורמים חיוניים ליצירת אורגנואידים טובים של כלי דם. התחל ליצור אגרגטים באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים בתרבית, או hPSCs, בעלי מפגש של 70%.

באמצעות פיפטה או מערכת ואקום, שאפו את מדיום התרבית והחליפו אותו במיליליטר אחד של מגיב דיסוציאציה של תאים לפני הדגירה על התאים למשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. בינתיים, הכינו את הנפח הדרוש של אמצעי צבירה בצינור חרוטי של 15 מיליליטר, בעקבות הניסוח המוזכר בכתב היד של הטקסט. לאחר הדגירה על התאים, שאפו את מגיב הדיסוציאציה התאית לפני השעיית התאים במיליליטר אחד של תווך הצבירה.

הקפיץ בעדינות את התוכן למעלה ולמטה כדי ליצור השעיה של תא יחיד. ספור את התאים באמצעות מכשיר ספירת תאים אוטומטי או תחת מיקרוסקופ, וחשב את מספר התאים הכולל הדרוש להיווצרות צבירה. קריאת הכדאיות של התא מציגה השעיה של תא בודד עם אשכולות נמוכים או ללא אשכולות.

שאפו את הסופרנאטנט מהצינור והוסיפו את הנפח המתאים של תרחיף התא למדיום הצבירה בצינור החרוטי פוליפרופילן בעל בהירות גבוהה של 15 מיליליטר והפייטו בעדינות את תרחיף התא המדולל מעלה ומטה כדי להבטיח פיזור תאים הומוגני. פיפטה שלושה מיליליטר של תרחיף התא המדולל לתוך כל באר רצויה של צלחת תרבית חיבור שש בארות אולטרה נמוכה. מניחים את הצלחת באינקובטור וממזערים כל הפרעה כדי לשמור על גודל וצורת האגרגטים.

הכינו את מדיית המזודרם כמתואר בכתב היד של הטקסט. 24 שעות לאחר הזריעה של התאים, מוציאים את צלחת התרבית מהאינקובטור. מערבלים את הצלחת בתנועה סיבובית כדי לצבור את האגרגטים במרכז כל באר.

באמצעות פיפטה של מיליליטר, מעבירים בעדינות את האגרגטים עם המדיום מכל באר לתוך הצינור החרוטי המתאים. אפשרו לאגרגטים לשקע בצינורות החרוטיים בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר השקיעה, שאפו את הסופרנאטנט עם פיפטה או משאבה בעלת רגישות גבוהה בזהירות מבלי להפריע לצברים המתיישבים.

השהה מחדש את האגרגטים בכל צינור על ידי הוספת שני מיליליטר של מדיום אינדוקציה מזודרם. לאחר מכן, להעביר את המתלה מכל צינור בחזרה לתוך הבאר המתאימה של צלחת חיבור אולטרה נמוך שש בארות תרבית. מניחים את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ומשאירים אותה עד היום הרביעי.

ביום הרביעי, הוציאו את צלחת התרבית מהאינקובטור, ואז נערו את הצלחת בתנועה סיבובית כדי לאסוף את האגרגטים במרכז כל באר. באמצעות פיפטה של מיליליטר, מעבירים בעדינות את האגרגטים עם המדיום שמסביב מכל באר לתוך הצינור החרוטי המתאים. כוונו טיימר למשך 30 דקות כדי לאפשר לצברים לשקע בצינורות.

לאחר שהמשקעים מצטברים, הכינו את לוחות התרבית כפי שהודגם קודם לכן והניחו אותם באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד היום השישי. להטבעה אגרגטית והשראת נבטי כלי, הכינו את הנפח הסופי הרצוי של תמיסת המטריצה החוץ תאית תוך כדי עבודה על קרח. פיפטה 500 מיקרוליטר של ECM לתוך באר אחת של צלחת 12 בארות כדי ליצור את השכבה הראשונה של כריך ECM.

כדי להבטיח פילמור יעיל של שכבת ECM הראשונה, מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לקראת סוף הדגירה בת השעתיים, מתחילים לעבוד עם האגרגטים בצלחת התרבית. אספו את האגרגטים במרכז כל באר לפני שתשתמשו בפיפט של מיליליטר כדי להעביר בעדינות את האגרגטים והמדיום מכל באר לצינור חרוטי מתאים של 15 מיליליטר.

הניחו לצברים להסתפק במשך 10 עד 15 דקות לפני שאתם שואפים את הסופרנטנט. לאחר מכן, לשמור את צינורות חרוט המכילים את האגרגטים על קרח במשך חמש דקות. עבודה מהירה וזהירה, להשעות מחדש את האגרגטים ב 500 מיקרוליטר של ECM ללא היווצרות בועה.

באמצעות פיפטה, שכב את מתלה אגרגציית ECM על גבי שכבת ECM הראשונה שכבר פולימרית בתוך הבאר בלוח 12 בארות. בינתיים, הכינו את אמצעי הנביטה כמתואר בכתב היד של הטקסט. לאחר שעתיים של דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, מוסיפים מיליליטר אחד של תווך הנבטה שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס לתוך הבאר כדי לגרום להתמיינות כלי הדם.

עבודה בתנאים סטריליים, השתמש בקצה המעוגל של מרית סטרילית כדי לשחרר את מטריצת הנבטת ECM המכילה את רשתות כלי הדם. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים סטריליים וקצה מעוגל של מרית סטרילית, מעבירים בזהירות את דיסק הג'ל המשוחרר על מכסה צלחת תרבית של 10 סנטימטרים. הניחו את הג'ל על המכסה תחת מיקרוסקופ סטריאו המותאם להגדלה ולמיקוד הרצויים, והשתמשו במחטים סטריליות כדי לחתוך רשתות כלי דם בודדים, בניסיון להגביל את כמות האק"מ הלא וסקולרי המתקבל בתהליך.

מעבירים בעדינות את האורגנואידים המבודדים חזרה לבאר אחת של צלחת בעלת שש בארות חיבור נמוכה במיוחד המכילה שלושה מיליליטר של תווך הנבטה. לאחר מכן, באמצעות פיפטה של מיליליטר, להעביר את אורגנואידים יחיד למספר המתאים של בארות בחיבור נמוך במיוחד 96 בארות לוחית. לאחר ההעברה, להוסיף 200 מיקרוליטר של אמצעי הנבטה שחומם מראש לתוך כל באר של צלחת 96 באר.

ארבעה עד שישה ימים לאחר הבידוד בצלחת של 96 בארות, ודא שלאורגנואידים יש מורפולוגיה עגולה ובריאה לפני שתמשיך לתקן ולהכתים אותם. תמונות של התקדמות הדרגתית של כלי הדם האנושי אורגנואיד, או hBVO, דור מ hPSCs צולמו תחת שדה בהיר. ביום האפס נוצרו אגרגטים בקוטר של 30 עד 100 מיקרון מתרבית hPSC.

שינויים קלים בגודל ובצורה של האגרגטים נצפו עם השראת מזודרם ביום הראשון, אשר השתנו עוד יותר ביום הרביעי כאשר האגרגטים עברו פריימינג וסקולרי. ניתן לצפות בהנבטת כלי דם מוקדמת כמעט רדיאלית ביום השביעי, יום לאחר הטמעת האגרגטים במטריצת הנבטה. מורפולוגיה בריאה של אורגנואידים והמשך הנבטת כלי דם נצפו ביום התשיעי, שהתקדם לכלי דם בשלב מאוחר שנבטו ביום ה-10 כאשר מבני התאים הצפופים במרכז האורגנואידים כמעט נעלמו.

מורפולוגיה אופיינית לאורגנואידים של כלי דם אנושיים בוגרים נצפתה בבירור ביום ה -15. צביעה שלמה של hBVOs בוגרים ביום ה -15 הציגה רשת אנדותל נרחבת ומחוברת שהייתה חיובית CD31 ומוקפת בטפילים PDGFR-בטא חיוביים ואקטין שריר אלפא חלק חיובי SMA. תאי הקיר PDGFR-beta-positive ו-SMA חיוביים העוטפים את רשתות כלי הדם של האנדותל נצפו היטב.

כמו כן נצפתה קרום מרתף רציף קולגן IV חיובי העוטף את רשתות כלי השיט. הבטחת פילמור תקין של המטריצה החוץ תאית בשלב ההטבעה היא קריטית להנבטה יעילה של כלי הדם. חוקרים השתמשו בטכנולוגיית האורגנואידים של כלי הדם שלנו כדי ליצור תאים מוקדמים של כלי דם במודלים אורגנואידים שכבר נקבעו, כגון מוח וכליות, שהיו בעבר אווסקולריים.