בידוד גרעינים מרקמת כבד קפואה עבור מולטיומיה חד-תאית

פרוטוקול קל וניתן לשחזור זה שימש בהצלחה לבידוד גרעינים באיכות גבוהה מכבדי מודל עכברים בריאים וחולים, כמו גם כבדים מפרימטים אנושיים ולא אנושיים. שיטה זו דורשת רק כמות קטנה של חומר רקמה קפואה. כמו כן, תמריץ כיתה צפיפות נותן השעיה גרעינית נקייה מאוד עם כל סוגי התאים העיקריים בכבד נשמר בהכנה הגרעינית הסופית.

שיטה זו של מיצוי גרעינים יכולה לשמש בדגימות כבד אנושיות בארכיון ביולוגי המאוחסנות בביו-בנקים. התחילו את הומוגניזציה של הרקמה על ידי חיתוך קובייה של 2230 מיליגרם או חמישה מילימטרים מרקמת כבד שהונחה בצלחת פטרי על קרח יבש באמצעות אזמל מקורר מראש. מעבירים מיד את צלחת הפטרי לקרח רטוב ומוסיפים מיליליטר אחד של חיץ הומוגניזציה.

באמצעות אזמל קר, טחון את הרקמה ככל האפשר, ומאפשר לו לשאוף עם קצה פתח רחב מיליליטר אחד. לאסוף את ההשעיה רקמה ולהעביר אותו מראש מקורר שני מיליליטר זכוכית dounce Homogenizer. לשטוף את צלחת פטרי עם עוד 0.521 מיליליטר של חיץ הומוגניזציה ולאסוף את כל חתיכות הרקמה הנותרות תוך שמירה על הכל על קרח.

לאט ובזהירות לבצע חמש משיכות עם מזיק A רופף על קרח מבלי ליצור בועות. ודא כי המזיק נע בזהירות מהחלק העליון לתחתית של ההומוגנייזר עם כל שבץ. לאחר מכן בצע 10 עד 15 משיכות איטיות עם מזיק B הדוק על קרח מבלי ליצור בועות.

לאחר שתסיים, סנן את ההומוגנט דרך מסננת תאים של 50 מיקרומטר תוך העברתו לצינור מקורר מראש של 1.5 מיליליטר. השתמש ביותר ממסנן או צינור אחד עבור הומוגנטים המכילים כמות גבוהה של גושי רקמת חיבור. שטפו את ההומוגנייזר ואת המסננים עם 0.521 מיליליטר נוסף של חיץ הומוגניזציה כדי לאסוף ביסודיות את כל ההומוגנטים של הרקמה לפני הצנטריפוגה של שיפוע הצפיפות.

עבור צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות, צנטריפוגה את ההומוגנט המסונן בצנטריפוגה בעלת זווית קבועה מקוררת מראש ב-1000 G למשך שמונה דקות בארבע מעלות צלזיוס. בזמן שהדגימה עוברת צנטריפוגה, הכינו צינור 1.5 מיליליטר המכיל 250 מיקרוליטרים של דילול 50% יודיקסנול וצינור אחד של שני מיליליטר המכיל 500 מיקרוליטרים של 29% דילול יודיקסנול. מניחים את שני הצינורות על קרח.

לאחר מכן מן ההשעיה צנטריפוגה, לשאוף את supernatant מבלי להפריע את הכדור באמצעות משאבת ואקום. השהה מחדש את הכדור ב-250 מיקרוליטרים של חיץ הומוגניזציה באמצעות קצה פיפטה ברוחב מיליליטר אחד. לאחר מכן מעבירים 250 מיקרוליטרים מתרחיף הגרעינים לצינור 1.5 מיליליטר מקורר מראש המכיל 250 מיקרוליטרים של 50% יודיקסנול ומערבבים אותו בעדינות וביסודיות כדי ליצור תרחיף גרעיני יודיקסנול 25%.

לאחר מכן, העבר 500 מיקרוליטרים של מתלה גרעיני 25% יודיקסנול לתוך צינור מיליליטר צינור מקורר מראש המכיל 500 מיקרוליטרים של 29% דילול יודיקסנול. צנטריפוגה את הצינור בצנטריפוגת דלי מתנדנדת מקוררת מראש ב 12, 500 גרם למשך 20 דקות, כאשר ההפסקה יוצאת לדרך. רגע לפני השלמת שלב הצנטריפוגה, הוסיפו את מעכבי ה-RNA למאגר אחסון הגרעינים, או NSB תוך כדי התקדמות לצינורות ריצוף ה-RNA של הגרעין היחיד.

לאחר השלמת הצנטריפוגה, לשאוף את supernatant מבלי להפריע את הכדור באמצעות משאבת ואקום. השהה בעדינות מחדש את הכדור ב-100 עד 300 מיקרוליטרים של NSB באמצעות קצה הפיתיון ברוחב מיליליטר אחד והעבר את תרחיף הגרעינים לצינור 1.5 מיליליטר נקי מקורר מראש. ספרו את הגרעינים באמצעות תמיסת טריפאן כחולה עם המוציטומטר ידני והשתמשו מיד במתלה הגרעינים המתקבל לבדיקת הגנומיקה של גרעין יחיד.

למיון תאים מבוסס ציטומטריה של זרימה, סנן את תרחיף הגרעינים דרך מסנן של 50 מיקרומטר לתוך חמישה מיליליטר פלואורסצנטיים מקוררים מראש המופעלים על ידי מיון תאים או צינור פקס. השתמש בממיין ציטומטריה של זרימה המצויד בזרבובית של 100 מיקרומטר וטען את צינור הפקס על הסדרן לפני תצוגה מקדימה של הדגימה. הגדר את אסטרטגיית הפיזור למיון הגרעינים, החל משער פיזור על ידי התוויית אזור הפיזור הקדמי לעומת אזור הפיזור הצדדי, לאחר מכן גובה מתיחה לעומת אזור מתיחה, ולאחר מכן רוחב מתיחה לעומת אזור מתיחה.

דמיינו את פרופיל הגרעינים על ההיסטוגרמה של האזור המתיחה. למיון ל-96 או 384 לוחות באר, הגדר את השהיית הטיפות ומטב את יישור הלוחות בשיטה colormetric. הגדר את קירור הדגימה ואת מחזיק הצלחת לארבע מעלות צלזיוס כאשר סיבוב הדגימה מופעל במהירות של 300 סל"ד.

מיין את הגרעינים הבודדים בריכוז דגימה של בערך פי 10 לגרעינים החמישים למיליליטר עם קצב זרימה של 200 עד 500 אירועים בשנייה. הבדיקה המיקרוסקופית של הגרעינים שהופקו מכבדים קפואים הראתה כי שלב הצנטריפוגה של שיפוע הצפיפות הקל מאוד על הסרת פסולת תאית ורקמות לא רצויה. מתודולוגיה זו שימרה את כל רמות הפלואידיה, אשר אומתה וכומתה על ידי ניתוח ציטומטרי.

מדדי איכות גבוהים נצפו מהנתונים שהתקבלו באמצעות מיצוי גרעינים. קירוב סעפת אחיד והקרנה ייצגו את מספר הספירות בכל הגרעינים וסוגי התאים העיקריים, אשר ניתן לזהות בביטחון רק עם תעתיק גרעיני וריצוף רדוד יחסית. גישה זו אפשרה לחקור גורמי שעתוק ספציפיים לכבד וגני מטרה במורד הזרם המעורבים בחילוף החומרים של קסנוביוטיקה.

התבנית המשלימה של גנים סימן היכר כגון, CYP2E1 הפריצנטרי והפריפורטל CYP2F2 הראתה כי הגרעינים שחולצו שמרו מידע קריטי על תרומת כבד. ספריית ביטוי הגנים של RNA רוצפה לעומק של 44, 600 קריאות לכל גרעין וספריית ATAC לעומק של 43, 500 קריאות לכל גרעין. ניתוח משוקלל של השכן הקרוב ביותר שבוצע עבור מדידות מרובות של שני האופנים, RNA בתוספת ATAC, תוך שימוש בחבילות Seurat ו- Signac איפשר זיהוי וביאור של סוגי תאי הכבד העיקריים והמינוריים ללא הטיות בולטות עקב גודל התא או שבריריות גרעינית.

בשיטה זו זוהו גם מווסתי השעתוק במעלה הזרם והגנים המוכרים של תרומת כבד. חשוב להימנע מיצירת בועות רבות מדי במהלך ההומוגניזציה של מטה בעת הזזת המזיקים למעלה ולמטה, ולהיצמד למספר המשיכות המצוין בפרוטוקול.