Name: בידוד גרעינים מרקמת כבד קפואה עבור מולטיומיה חד-תאית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: למדו פרוטוקול לבידוד גרעינים מרקמת כבד קפואה באמצעות צנטריפוגציה בגרדיאנט צפיפות. השיטה שומרת על רמות פלואידיות ומגוון סוגי תאים לניתוח RNA-seq ו-ATAC-seq בודד-גרעיני.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי קמפוס חלוץ הלמהולץ (M.S., K.Y., C.P.M.-J.) והמכון לביולוגיה חישובית (C. T.-L.). מחקר זה נתמך גם על ידי AMED תחת מענק מספר JP20jm0610035 (C.P.M.-J.). אנו מודים לגנומיקה המרכזית ב-HMGU (I. de la Rosa) ובביואינפורמטיקה (T. Walzthoeni), ובמיוחד ל-Xavier Pastor על הכשרה והדרכה. אנו מודים ל- A. Feuchtinger, U. Buchholz, J. Bushe, ולכל שאר אנשי הצוות ממתקן הליבה הפתולוגי והאנליטי של רקמות HMGU על תמיכתם הטכנית והמדעית, כמו גם, J. Zorn, R. Erdelen, D. Würzinger, אנשי הצוות של E-Streifen, כמו גם למתקן הליבה של שירותי חיות המעבדה על התמיכה והדיון המדעיים המתמשכים שלהם. אנו אסירי תודה לניתוח תאי מתקן הליבה ב- TranslaTUM (ר 'מישרה), ו- Luminex, חברת DiaSorin (פ' ריין). אנו מודים לד"ר אי דליגיאניס על תמיכתו הטכנית. ד"ר מ. הרטמן, ד"ר א. שרדר וגב' א. בארדן (קמפוס חלוץ הלמהולץ) היו הבסיס לתמיכתם המשפטית, הניהולית והאדמיניסטרטיבית.

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לחקיקה הגרמנית לרווחת בעלי חיים ולתקנות ממשלת בוואריה עילית. דיור לבעלי חיים אושר על פי §11 של החוק הגרמני לרווחת בעלי חיים ובוצע בהתאם להנחיה 2010/63/EU.
1. הכנת רקמות
<ol><li>להקריב עכבר C57BL/6J זכר בן 3 חודשים עד 22 חודשים על ידי נקע צוואר הרחם. הניחו את החיה על קרש ניתוח, אבטחו את הגפיים עם סיכות וחטאו את הבטן עם 70% אתנול.</li>
	<li>בצע נמק כפי שהומלץ על ידי Treuting et al.16.<ol><li>פתח את הבטן עד לצלעות, דמיינו את הכבד, והשתמשו במלקחיים כדי להסיר בזהירות את הכבד מבלי לחדור את האונות.</li>
		<li>חלץ את הכבד השלם על ידי החזקת הסרעפת עם מלקחיים והסרת הרקמה המחברת עם מספריים.</li>
	</ol></li>
	<li>שוטפים את האיבר בתמיסת מלח קרה עם פוספטים (PBS), מייבשים אותו על מגבת נייר נקייה וחותכים את אונות הכבד למספר חלקים למטרות שונות: FF לבידוד גרעין יחיד ומולטיומיה; פרפורמלדהיד קבוע (10% PFA) להטמעת פרפין; ו/או מוטמע בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) לצורך ניתוחים היסטולוגיים נוספים (איור 1A).</li>
	<li>Aliquot את חתיכות הכבד לתוך cryovials או 5 מ"ל בורג מכסה צינורות, ומיד הבזק להקפיא חנקן נוזלי. אחסנו את דגימות הכבד הקפואות בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס עבור ניסויי מולטיומיקה של גרעין יחיד במורד הזרם (איור 1B, C). הערה: ניתן לאחסן בבטחה את הרקמה בהקפאה בטמפרטורה של 80°C- למשך מספר שנים, ויש לשנע אותה תמיד על קרח יבש בטמפרטורה של 80°C- לפני השימוש.</li>
</ol>2. בידוד גרעינים
<ol><li>ניקוי ספסלים והכנת המאגרים והחומרים המתכלים<ol><li>נקו את משטחי הספסלים והפיפטות העובדים עם 70% אתנול ותמיסת RNase לפירוק, או השתמשו במשטחי ספסל וחומרים ייעודיים ללא RNase.</li>
		<li>קדם הן את הדלי המתנדנד והן את הצנטריפוגות בעלות הזווית הקבועה, צינורות 1.5 מ"ל/2 מ"ל, ולוחות מרובי בארות ל-4 מעלות צלזיוס, כמפורט להלן.</li>
		<li>הכינו מראש את הפינצטה החד-פעמית נטולת ה-RNase המשמשת לטיפול ברקמות, אזמל סטרילי חד פעמי וצלחת פטרי על קרח יבש (−60 מעלות צלזיוס).</li>
		<li>Prechill את ההומוגנייזר זכוכית Dounce ומזיקים על קרח (4 °C (4 °F). הכניסו כל מזיק (A ו-B) לתוך צינור של 5 מ"ל כדי למנוע מגע ישיר עם הקרח וזיהום RNase פוטנציאלי.</li>
		<li>הכינו תמיסה מדוללת של מדיום יודיקסנול (IDM) (טבלה 1A), והשתמשו בה כדי לבצע דילולים של 50% ו-29% מהמדיום ההדרגתי של צפיפות מלאי יודיקסנול של 60% (טבלה 1B וטבלה 1C, בהתאמה).</li>
		<li>Prechill כל הצינורות. עבור כל דגימה כי הוא הולך להיות מעובד, להכין את הצינורות הבאים:<ol><li>הכינו שלושה צינורות קשירה בעלי DNA נמוך של 1.5 מ"ל (אחד עבור הומוגנט הרקמה המסוננת, השני המכיל 250 μL של דילול 50% של תמיסת יודיקסנול, ושלישית עבור תרחיף הגרעינים הנקיים).</li>
			<li>הכן צינור אחד בעל תחתית עגולה של 2 מ"ל המכיל 500 μL של דילול של 29% של תמיסת יודיקסנול להפרדת גרדיאנט הצפיפות.</li>
			<li>הכינו צינור חרוטי אחד של 15 מ"ל לבידוד גרעינים בינוני-2 (NIM-2) ומאגר הומוגניזציה (HB).</li>
		</ol></li>
		<li>הכן את בידוד הגרעינים בינוני-1 (NIM-1) (טבלה 1D), והשתמש בו כדי ליצור את NIM-2 (טבלה 1E) ולאחר מכן, את HB (טבלה 1F). הוסיפו את שני מעכבי ה-RNAse ממש לפני השימוש, כפי שמתואר להלן בפרוטוקול.</li>
		<li>הכן את מאגר אחסון הגרעינים (NSB) כמתואר בטבלה 1G. יש להוסיף מעכב RNAse רקומביננטי ממש לפני השימוש. הוסיפו מעכב RNAse מבוסס חלבון ל-NSB לפני השימוש במיון FACS (אופציונלי).</li>
		<li>הכינו של 500 מ"ל עם מים סטריליים כדי להשרות את ההומוגנייזרים והמזיקים של Dounce לאחר הומוגניזציה של הרקמות לניקוי ותחזוקה אופטימליים של ההומוגנייזרים.</li>
	</ol></li>
	<li>הומוגניזציה של רקמות<ol><li>חותכים חתיכת רקמה של 20-30 מ"ג (או 5 מ"מ3) עם אזמל מוכן מראש בתוך צלחת פטרי על קרח יבש. לאחר מכן, מיד להעביר את צלחת פטרי לקרח רטוב (4 מעלות צלזיוס). הוסף 1 מ"ל של HB, ובאמצעות אזמל קר, לטחון את הרקמה ככל האפשר כדי לאפשר לו להיות שואף בקלות עם קצה 1 מ"ל רחב פתח. הערה: השתמש תמיד בטיפים רחבים לכל העברות הרקמות/גרעינים. כחלופה, ניתן לחתוך קצוות של 1 מ"ל עם אזמל סטרילי על כיסוי פלסטיק סטרילי כדי ליצור פתחים רחבים (איור 2A).</li>
		<li>אספו את תרחיף הרקמות, והעבירו אותו לזכוכית Dounce הומוגנייזר של 2 מ"ל (איור 2B).</li>
		<li>שטפו את צלחת הפטרי עם תוספת של 0.5-1 מ"ל של HB, ואספו את כל חתיכות הרקמה הנותרות תוך שמירה על הכל על קרח.</li>
		<li>לאט ובזהירות לעשות חמש משיכות עם מזיק A רופף על קרח. הימנעו מיצירת בועות על ידי שימוש בתנועות פיתול של המזיק בעת משיכתו למעלה ולמטה. ודא כי המזיק נע בזהירות מהחלק העליון לתחתית של ההומוגנייזר עם כל שבץ.</li>
		<li>לאחר מכן, בצע 10-15 משיכות איטיות עם מזיק B הדוק על קרח. הימנעו מיצירת בועות. הערה: מומלץ לבדוק באופן חזותי את הגרעינים מתחת למיקרוסקופ לאחר 10 פעימות עם מזיק B כדי לוודא אם יש צורך במשיכות נוספות. עשו זאת על ידי שימוש בכתמים כחולים של טריפאן (יחס של 1:1 בין טריפאן לדגימה) ובהמוציטומטר ידני (למשל, לערבב 10 μL של טריפאן כחול עם 10 μL של תרחיף גרעינים, ולהשתמש ב-10 μL של התערובת לבדיקה תחת המיקרוסקופ; איור 2C).</li>
		<li>מסננים את ההומוגנט דרך מסננת תאים בקוטר 50 מיקרומטר תוך כדי העברתו לצינור 1.5 מ"ל מוכן מראש. יש להשתמש ביותר ממסנן ו/או צינור אחד עבור הומוג'נטים המכילים כמות גבוהה של גושי רקמת חיבור.</li>
		<li>שטפו את ההומוגנייזר ואת המסננים המשמשים עם 0.5-1 מ"ל נוספים של HB כדי לאסוף ביסודיות את כל ההומוגנט של הרקמות. המשך לצנטריפוגה של שיפוע הצפיפות.</li>
	</ol></li>
	<li>צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות<ol><li>צנטריפוגה ההומוגנית המסוננת בצנטריפוגה קבועה בזווית קבועה ב-1,000 × גרם למשך 8 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>בזמן שהדגימה מסתובבת, הכינו שפופרת של 1.5 מ"ל המכילה 250 μL של דילול 50% יודיקסנול וצינור אחד של 2 מ"ל המכיל 500 μL של 29% דילול יודיקסנול. שמור את שני הצינורות על קרח.</li>
		<li>לאחר צנטריפוגה, שאפו את הסופר-נטנט מבלי להפריע לכדור באמצעות משאבת ואקום. הערה: שימוש בצנרת ידנית יפגע באיכות מתלי הגרעינים הסופיים.</li>
		<li>הוסיפו 250 μL של HB לכדור באמצעות קצה פיפטה רחב של 1 מ"ל, ושתו באיטיות רבה.</li>
		<li>מעבירים 250 מיקרוליטר מתרחיף הגרעינים לתוך צינור 1.5 מ"ל קדמי המכיל 250 μL של 50% דילול יודיקסנול, ומערבבים בעדינות אך ביסודיות כדי ליצור תרחיף 25% יודיקסנול/גרעינים.</li>
		<li>העבר 500 μL מתרחיף 25% יודיקסנול/גרעינים לתוך צינור 2 מ"ל מוכן מראש המכיל 500 μL של 29% דילול יודיקסנול. הערה: יש להפקיד בעדינות את 500 μL של תרחיף 25% יודיקסנול/גרעינים על גבי תמיסת 500 μL של 29% יודיקסנול, כך שתערובות 25%/29% יודיקסנול מראות הפרדת פאזה ברורה. השתמש בצד של קיר הצינור כאשר קצה הפיפטה ממוקם בזווית של 45° כדי ליצור ממשק הדרגתי זה. מכאן ואילך, יש לטפל בצינור בעדינות כדי לא להפריע לשיפוע זה.</li>
		<li>צנטריפוגה את הצינור בצנטריפוגת דלי מתנדנדת מראש ב 12,500 גרם במשך 20 דקות עם הבלם מוגדר OFF.</li>
		<li>רגע לפני השלמת שלב הצנטריפוגה, הוסיפו את מעכבי ה-RNAse למאגר ה-NSB כאשר אתם ממשיכים לצינורות scRNA-seq (ראו טבלה 1G).</li>
		<li>לאחר צנטריפוגה, שאפו את הסופר-נטנט מבלי להפריע לכדור באמצעות משאבת ואקום. הערה: שימוש בצנרת ידנית יפגע באיכות מתלי הגרעינים הסופיים.</li>
		<li>באמצעות קצה פיפטה רחב של 1 מ"ל, יש לתלות בעדינות את הכדור ב-100-300 מיקרון של NSB, ולהעביר את תלייה הגרעינים לצינור נקי ומצונן מראש של 1.5 מ"ל.</li>
		<li>לספור את הגרעינים באמצעות תמיסת טריפאן כחולה (יחס של 1:1 בין טריפאן לדגימה) והמוציטומטר ידני (למשל, לערבב 10 μL של כחול טריפאן עם 10 μL של תרחיף גרעינים, ולהשתמש 10 μL של התערובת לספירה; איור 2D).</li>
		<li>השתמש בהשעיית הגרעינים המתקבלת באופן מיידי לבדיקת הגנומיקה של גרעין יחיד. הערה: ניתן לאחסן את תרחיף הגרעינים ב-NSB בקירור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע אחד לצורך ניתוח נוסף על ידי ציטומטריה של זרימה ו/או הדמיה, אך לא עבור snRNA-seq או snATAC-seq.</li>
	</ol></li>
</ol>3. מיון גרעינים עבור פרופיל פלואידי הפטוציטים או גישות ריצוף מבוססות היטב
<ol><li>למיון תאים מבוסס ציטומטריה של זרימה, סנן את תרחיף הגרעינים דרך מסנן של 50 מיקרומטר לתוך צינור FACS של 5 מ"ל מראש.</li>
	<li>השתמש סדרן ציטומטריה זרימה מצויד זרבובית 100 מיקרומטר. טען את צינור FACS על הממיין והצג תצוגה מקדימה של הדגימה.</li>
	<li>הגדר את אסטרטגיית ההטיה למיון הגרעינים, החל משער פיזור על ידי התוויית אזור הפיזור הקדמי לעומת אזור הפיזור הצדדי (FSC-A/SSC-A), לאחר מכן Hoechst-Height לעומת Hoechst-Area (שער גרעינים), ולאחר מכן Hoechst-Width לעומת Hoechst-Area (שער סינגלט). דמיינו את פרופיל הגרעינים בהיסטוגרמה של אזור Hoechst. הערה: לקבלת רזולוציית שיא טובה יותר, דמיינו את ערוץ Hoechst (450/50) בסולם הליניארי (איור 3A).</li>
	<li>למיון ללוחות 96/384-well, הגדר את השהיית הטיפות, ומטב את יישור הלוחות בשיטה colorimetric עם בנזידין מצע-חזרת peroxidase (TMB-HRP), כפי שתואר קודםלכן 6.</li>
	<li>הגדר הן את קירור הדגימה והן את מחזיק הצלחת לקירור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, כאשר סיבוב הדגימה מופעל ב-300 סל"ד.</li>
	<li>מיין את הגרעינים הבודדים בריכוז דגימה של ~ 1 x 105 גרעינים / מ"ל ועם קצב הזרימה ב 200-500 אירועים / שנייה.</li>
</ol>4. בדיקה חזותית וכימות של פרמטרים גרעיניים על ידי הדמיה ציטומטריה (אופציונלי)
<ol><li>טען צינור של 0.5 מ"ל המכיל 50 μL של תרחיף הגרעינים בריכוז של 2 × 107 גרעינים למ"ל.</li>
	<li>הגדר שער לכל האירועים בהתבסס על יחס הגובה-רוחב לעומת ערוץ הפלואורסצנציה של Hoechst כדי להמחיש את פרופיל הגרעינים (איור 3B).</li>
	<li>קבל את הדגימה בהגדלה של 40x באמצעות שדה בהיר (BF) וערוץ הפלואורסצנציה Hoechst.</li>
	<li>בדוק וכמת גרעיני 2n ו-4n באמצעות מדידת שדה בהיר ועוצמת פלואורסצנציה של Hoechst באמצעות תוכנת הדמיה ציטומטרית (איור 3C).</li>
</ol>5. גרעין יחיד RNA-seq, ATAC-seq, או בנייה וריצוף של ספרייה רב-ערוצית
<ol><li>עבור גישות snRNA-seq המבוססות על טיפות, טען את תרחיף הגרעינים המטוהרים ישירות לתוך ההתקן המיקרופלואידי למחיצות מקביליות אוטומטיות וברקוד מולקולרי17.</li>
	<li>לאחר השלמת הריצה המיקרופלואידית בהתקן החלוקה החד-תאית, אספו את הגרעינים עטופים בג'ל חרוזים, דגרו ונקו כפי שתואר קודם לכן בהנחיות היצרן17.</li>
	<li>בצע 11 מחזורי תגובת שרשרת פולימראז (PCR) עבור קדם-הגברה של cDNA באמצעות התוכנית הבאה: 3 דקות ב-98 °C, (15 שניות ב-98°C, 20 שניות ב-63°C, ודקה אחת ב-72°C) x 11, דקה אחת ב-72°C, והחזקה ב-4°C. המשך עם תיקון קצה ושלב זנב A וקשירת מתאם, כפי שצוין על ידי היצרן17. לבניית ספריית ביטוי הגנים הסופית שלאחר מכן, בצע 10 מחזורי PCR באמצעות התוכנית הבאה: 45 שניות ב- 98 °C, (20 שניות ב- 98 ° C, 30 שניות ב- 54 ° C, 20 שניות ב- 72 ° C) x 10, דקה אחת ב- 72 ° C, והחזק ב- 4 ° C.</li>
	<li>רצף את הספריות המתקבלות לעומק קריאה של ~20,000-50,000 קריאות ממוצעות לכל גרעין.</li>
	<li>עבור ריצוף מבוסס טיפות של מולטיומיקה משותפת (RNA + ATAC), יש לדגום את גרעיני הכבד במאגר הליזיס למשך 5 דקות, ולאחר מכן לתייג אותם למשך שעה אחת, כפי שתואר קודםלכן 18.</li>
	<li>טען את הגרעינים המתויגים ישירות לתוך התקן מיקרופלואידי למחיצות מקביליות אוטומטיות וברקוד מולקולרי.</li>
	<li>לאחר השלמת הריצה המיקרופלואידית, אספו את הגרעינים עטופים בחרוזי ג'ל, דגירה וניקוי כפי שתואר על ידי היצרן18.</li>
	<li>בצע שישה מחזורי PCR לשלב ההגברה של cDNA באמצעות התוכנית הבאה: 5 דקות ב- 72 °C, 3 דקות ב- 98 °C, (20 שניות ב- 98 °C, 30 שניות ב- 63 ° C, דקה אחת ב- 72 ° C) x 6, דקה אחת ב- 72 ° C, והחזק ב- 4 ° C.</li>
	<li>קח 35 μL של הדגימה preamplified, ולבצע הגברה cDNA כדלקמן: 3 דקות ב 98 °C, (15 שניות ב 98 °C, 20 שניות ב 63 °C, 1 דקות ב 72 °C) x 6, 1 דקות ב 72 °C, ולהחזיק ב 4 °C. המשך עם תיקון הקצה ושלב A-tailing וקשירת המתאם, כפי שצוין על ידי היצרן18 . עבור האינדקס הסופי הבא של PCR, בצע 15 מחזורי PCR כדלקמן: 45 שניות ב- 98 °C, (20 שניות ב- 98 ° C, 30 שניות ב- 54 ° C, 20 שניות ב- 72 ° C) x 15, דקה אחת ב- 72 ° C, והחזק ב- 4 ° C.</li>
	<li>לבניית ספריות ATAC, השתמש ב- 40 μL, והגבר עבור שישה מחזורי PCR לאינדקס דגימות באמצעות התוכנית הבאה: 45 שניות ב- 98 ° C, (20 שניות ב- 98 ° C, 30 שניות ב- 67 ° C, 20 שניות ב- 72 ° C) x 6, דקה אחת ב- 72 ° C, והחזק ב- 4 ° C.</li>
	<li>רצף ספריות ביטוי הגנים הרב-תכליתיים המתקבלים לעומק קריאה מינימלי של 20,000 זוגות קריאה לכל גרעין וספריות ATAC מרובות לעומק קריאה מינימלי של 25,000 זוגות קריאה לכל תא, לפי המלצת היצרן18.</li>
</ol>

<ol><li>Kamies, R., Martinez-Jimenez, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+of+single-cell+genomics+and+epigenomics+in+human+disease%3A+where+are+we+now%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm+Genome%22%5BJournal%5D)">Advances of single-cell genomics and epigenomics in human disease: where are we now.</a> Mamm Genome. 31 (5-6), 170-180 (2020).</li>
<li>Ramachandran, P., Matchett, K. P., Dobie, R., Wilson-Kanamori, J. R., Henderson, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+technologies+in+hepatology%3A+New+insights+into+liver+biology+and+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Single-cell technologies in hepatology: New insights into liver biology and disease pathogenesis.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 17 (8), 457-472 (2020).</li>
<li>Ramachandran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+fibrotic+niche+of+human+liver+cirrhosis+at+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Resolving the fibrotic niche of human liver cirrhosis at single-cell level.</a> Nature. 575 (7783), 512-518 (2019).</li>
<li>Andrews, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell%2C+single-nucleus%2C+and+spatial+RNA+sequencing+of+the+human+liver+identifies+cholangiocyte+and+mesenchymal+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell, single-nucleus, and spatial RNA sequencing of the human liver identifies cholangiocyte and mesenchymal heterogeneity.</a> Hepatology Communications. 6 (4), 821-840 (2022).</li>
<li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+intercellular+crosstalk+in+healthy+and+NASH+liver+revealed+by+single-cell+secretome+gene+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Landscape of intercellular crosstalk in healthy and NASH liver revealed by single-cell secretome gene analysis.</a> Molecular Cell. 75 (3), 644-660 (2019).</li>
<li>Richter, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+RNA-seq2+reveals+functional+crosstalk+between+liver+zonation+and+ploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus RNA-seq2 reveals functional crosstalk between liver zonation and ploidy.</a> Nature Communications. 12 (1), 4264(2021).</li>
<li>Matsumoto, T., Wakefield, L., Tarlow, B. D., Grompe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+lineage+tracing+of+polyploid+hepatocytes+reveals+extensive+proliferation+during+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo lineage tracing of polyploid hepatocytes reveals extensive proliferation during liver regeneration.</a> Cell Stem Cell. 26 (1), 34-47 (2020).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+distribution+of+hepatocyte+proliferation+in+liver+homeostasis+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Broad distribution of hepatocyte proliferation in liver homeostasis and regeneration.</a> Cell Stem Cell. 26 (1), 27-33 (2020).</li>
<li>Donne, R., Saroul-Ainama, M., Cordier, P., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyploidy+in+liver+development%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Polyploidy in liver development, homeostasis and disease.</a> Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 17 (7), 391-405 (2020).</li>
<li>Lengefeld, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+size+is+a+determinant+of+stem+cell+potential+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Cell size is a determinant of stem cell potential during aging.</a> Science Advances. 7 (46), 0271(2021).</li>
<li>Lanz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+cell+size+remodels+the+proteome+and+promotes+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Increasing cell size remodels the proteome and promotes senescence.</a> Mol Cell. 82 (17), 3255-3269 (2022).</li>
<li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIDDosome-SCAP+crosstalk+controls+high-fructose-diet-dependent+transition+from+simple+steatosis+to+steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">PIDDosome-SCAP crosstalk controls high-fructose-diet-dependent transition from simple steatosis to steatohepatitis.</a> Cell Metabolism. 34 (10), 1548-1560 (2022).</li>
<li>Padovan-Merhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+mammalian+cells+compensate+for+differences+in+cellular+volume+and+DNA+copy+number+through+independent+global+transcriptional+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Single mammalian cells compensate for differences in cellular volume and DNA copy number through independent global transcriptional mechanisms.</a> Molecular Cell. 58 (2), 339-352 (2015).</li>
<li>Miettinen, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+transcriptional+and+metabolic+programs+related+to+mammalian+cell+size%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of transcriptional and metabolic programs related to mammalian cell size.</a> Current Biology. 24 (6), 598-608 (2014).</li>
<li>Vargas-Garcia, C. A., Ghusinga, K. R., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+size+control+and+gene+expression+homeostasis+in+single-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell size control and gene expression homeostasis in single-cells.</a> Current Opinion in Systems Biology. 8, 109-116 (2018).</li>
<li>Knoblaugh, S. E., Randolph-Habecker, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnoblaugh%2C+SE+%22Necropsy+and+histology.+In+Comparative+Anatomy+and+Histology%3A+A+Mouse%2C+Rat%2C+and+Human+Atlas+%28Second+Edition%29%22">Necropsy and histology. In Comparative Anatomy and Histology: A Mouse, Rat, and Human Atlas (Second Edition)</a>. , Academic Press. Cambridge, MA. Chapter 3 (2018).</li>
<li>Chromium Next GEM Single Cell 3 Reagent Kits v3.1 User Guide. Document number CG000204 (Rev D). 10x Genomics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry</a> (2019).</li>
<li>Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide. Document number CG000338 (Rev D). 10x Genomics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-next-gem-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-reagent-kits-user-guide">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-next-gem-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-reagent-kits-user-guide</a> (2021).</li>
<li>MacParland, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+RNA+sequencing+of+human+liver+reveals+distinct+intrahepatic+macrophage+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single cell RNA sequencing of human liver reveals distinct intrahepatic macrophage populations.</a> Nature Communications. 9 (1), 4383(2018).</li>
<li>Martinez-Jimenez, C. P., Kyrmizi, I., Cardot, P., Gonzalez, F. J., Talianidis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+nuclear+factor+4alpha+coordinates+a+transcription+factor+network+regulating+hepatic+fatty+acid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte nuclear factor 4alpha coordinates a transcription factor network regulating hepatic fatty acid metabolism.</a> Molecular and Cell Biology. 30 (3), 565-577 (2010).</li>
<li>Schmidt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five-vertebrate+ChIP-seq+reveals+the+evolutionary+dynamics+of+transcription+factor+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Five-vertebrate ChIP-seq reveals the evolutionary dynamics of transcription factor binding.</a> Science. 328 (5981), 1036-1040 (2010).</li>
<li>Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+analysis+of+multimodal+single-cell+data%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrated analysis of multimodal single-cell data.</a> Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).</li>
<li>Stuart, T., Srivastava, A., Madad, S., Lareau, C. A., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+chromatin+state+analysis+with+Signac%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell chromatin state analysis with Signac.</a> Nature Methods. 18 (11), 1333-1341 (2021).</li>
<li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholangiocyte+organoids+can+repair+bile+ducts+after+transplantation+in+the+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cholangiocyte organoids can repair bile ducts after transplantation in the human liver.</a> Science. 371 (6531), 839-846 (2021).</li>
<li>Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatocytes+as+a+tool+for+studying+toxicity+and+drug+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Human hepatocytes as a tool for studying toxicity and drug metabolism.</a> Current Drug Metabolism. 4 (4), 292-312 (2003).</li>
<li>Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatocytes+in+primary+culture%3A+The+choice+to+investigate+drug+metabolism+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Human hepatocytes in primary culture: The choice to investigate drug metabolism in man.</a> Current Drug Metabolism. 5 (5), 443-462 (2004).</li>
<li>vanden Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li>
<li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows.</a> Genome Biology. 21 (1), 130(2020).</li>
<li>Nault, R., Fader, K. A., Bhattacharya, S., Zacharewski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nuclei+RNA+sequencing+assessment+of+the+hepatic+effects+of+2%2C3%2C7%2C8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Single-nuclei RNA sequencing assessment of the hepatic effects of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 11 (1), 147-159 (2021).</li>
<li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li>
<li>Duncan, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+as+a+mechanism+for+stress-induced+liver+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy as a mechanism for stress-induced liver adaptation.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (9), 3307-3315 (2012).</li>
<li>Kreutz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+ploidy+is+a+diversity+factor+for+liver+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte ploidy is a diversity factor for liver homeostasis.</a> Frontiers in Physiology. 8, 862(2017).</li>
<li>Hunt, N. J., Kang, S. W. S., Lockwood, G. P., Le Couteur, D. G., Cogger, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+aging+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of aging in the liver.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 1151-1161 (2019).</li>
<li>Bou-Nader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyploidy+spectrum%3A+a+new+marker+in+HCC+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification.</a> Gut. 69 (2), 355-364 (2019).</li>
<li>Gentric, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+promotes+pathologic+polyploidization+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).</li>
<li>Schwartz-Arad, D., Zajicek, G., Bartfeld, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+streaming+liver+IV%3A+DNA+content+of+the+hepatocyte+increases+with+its+age%5BTitle%5D)+AND+%22Liver%22%5BJournal%5D)">The streaming liver IV: DNA content of the hepatocyte increases with its age.</a> Liver. 9 (2), 93-99 (1989).</li>
<li>Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatocyte+polyploidization+kinetics+in+the+course+of+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Archiv.+B%2C+Cell+Pathology+Including+Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle.</a> Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (6), 387-393 (1993).</li>
<li>Duncan, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ploidy+conveyor+of+mature+hepatocytes+as+a+source+of+genetic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation.</a> Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).</li>
<li>Granja, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ArchR+is+a+scalable+software+package+for+integrative+single-cell+chromatin+accessibility+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">ArchR is a scalable software package for integrative single-cell chromatin accessibility analysis.</a> Nature Genetics. 53 (3), 403-411 (2021).</li>
<li>Bredikhin, D., Kats, I., Stegle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUON%3A+Multimodal+omics+analysis+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">MUON: Multimodal omics analysis framework.</a> Genome Biology. 23 (1), 42(2022).</li>
<li>Velten, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+temporal+and+spatial+patterns+of+variation+from+multimodal+data+using+MEFISTO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Identifying temporal and spatial patterns of variation from multimodal data using MEFISTO.</a> Nature Methods. 19 (2), 179-186 (2022).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

ניתוח ההרכב התאי של הכבד על ידי RNA-seq חד-תאי או חד-גרעיני מספק הבנה מעמיקה יותר של התפתחות מחלות כבד והתקדמותן 3,4,5,24. בידוד חד-תאי מכבדים גוזל זמן רב ודורש פרוטוקולים הכוללים דיסוציאציה מכנית או אנזימטית קשה25,26,27. מקובל כי כל רקמה דורשת הערכה שיטתית כדי לקבוע את פרוטוקול הדיסוציאציה האופטימלי של הרקמה, כמו גם שיטת אחסון מתאימה ללכידת סוגי תאים שבירים או גרעינים28. בהתאם לזמינות הרקמות, למחלה המעניינת, לשלב ההתפתחותי או לאורגניזם המודל, הכנת תרחיף בעל גרעין יחיד לעיבוד במורד הזרם עשויה להיות מתודולוגיה מתאימה יותר מאשר שימוש במתלים חד-תאיים. חשוב לציין שבכבד, scRNA-seq ו-snRNA-seq הראו מתאם גבוה בין mRNA גרעיני וציטופלסמי, מה שמרמז על כך ששתי הגישות מציגות מידע משלים 2,3,4,6,29.
מאמר זה מספק בידוד סטנדרטי, חזק וניתן לשחזור של גרעין יחיד מדגימות כבד קפואות בארכיון מעכברים וממינים אחרים, כולל בני אדם וקופי מקוק. ניתן להשתמש בשיטה זו עבור עכברים מסוג בר הניזונים מצ'או ותזונה עתירת שומן (HFD) ולמודלים של עכברים של פיברוזיס בכבד תוך שימוש הן בגישות גנומיות מבוססות צלחת והן בגישות גנומיות מבוססות טיפות6. שיטה זו מסתמכת על הפרוטוקול שתואר במקור עבור רקמת המוח על ידי Krishnaswami et al.30 עם שינויים נוספים המותאמים לכבד קפוא פלאש. הומוגניזציה אופטימלית משחררת את רוב הגרעינים מהרקמה מבלי להשפיע לרעה על שלמות קרום הגרעין. עם זאת, שטיפת יתר עלולה לפגוע בגרעינים השבריריים ולפגוע באיכותם הכללית. כבדים צעירים ו/או שומניים זקוקים בדרך כלל ל-5 פעימות בלבד עם מזיק A ו-10 פעימות עם מזיק B, בעוד כבדים ישנים ו/או פיברוטיים עשויים להזדקק ל-15 פעימות עם מזיק B אך לא יותר. לא מומלץ, אם כן, לבצע משיכות נוספות מעבר למספרים שצוינו כאן. שטיפת יתר עלולה להשפיע לרעה על איכות ההשעיה בעלת הגרעין הבודד ולהגדיל את כמות הרנ"א הסביבתי. לאחר מכן, הדבר עשוי להוביל לצורך בביצוע שלבי סינון חישוביים נוספים במהלך ניתוחי הנתונים במורד הזרם.
הפרוטוקול המוצג כאן הוא רב-תכליתי וניתן להתאים אותו למצבי כבד שונים בעכברים צעירים (3 חודשים) ומבוגרים (24 חודשים). מאחר שמצאנו שחלק גדול יותר של הכבד נחוץ לרקמות ישנות, HFD ופיברוטיות, גודל הרקמה הזמין לעיבוד יכול להוות מגבלה עבור חלק מהמשתמשים עם כמויות קטנות יותר של חומר ביולוגי התחלתי. עם זאת, טיהור הדרגתי מומלץ מאוד לעיבוד דגימה מיידי עם בדיקות גנומיות מבוססות טיפות. אם הגרעינים צריכים להיות ממוינים ל-FACS ללוחות 96/384-well עבור מבחנים מבוססים היטב, ניתן להשמיט טיהור הדרגתי. אנו ממליצים למשתמשים עדיין לבצע את טיהור השיפוע אם יש מספיק דגימת רקמה כדי להשיג את ריכוז הגרעינים המומלץ למיון FACS (כלומר, ~1 × 105 גרעינים למ"ל).
הכבד מאופיין באופי הפוליפלואידי של הפטוציטים9, אך תפקידה של פלואידית הפטוציטים בפיזיולוגיה ומחלה רגילה עדיין לא ברור. יש יותר ויותר עדויות המצביעות על כך שפלואידיה מספקת שונות גנומית31, וידוע כי פלואידיה עולה עם גיל32,33. עם זאת, העשרה של הפטוציטים טטרפלואידים חד-גרעיניים קשורה קלינית גם לפרוגנוזה גרועה בקרצינומה הפטוצלולרית אנושית (HCC)34. באופן דומה, שינויים ברמות פלואידיה של הפטוציטים קשורים למחלות כבד כרוניות הקשורות להזדקנות, כגון מחלת כבד שומני שאינה אלכוהולית (NAFLD)35,36,37. פלואידי הוא מצב של החזקת יותר משני עותקים של הגנום, אשר ניתן לחקור על ידי צביעת תוכן הגנום עם צבע DNA כגון Hoechst38. צבע Hoechst, שנוסף ל-HB לפני המיצוי, מסמן את כל הגרעינים במהלך פרוטוקול הבידוד. זה מאפשר את ההבחנה בין גרעינים דיפלואידים ופוליפלואידים בהתבסס על תכולת הדנ"א שלהם כאשר הם מתרגשים על ידי לייזר UV (350 ננומטר) או סגול (450 ננומטר) במכשיר ציטומטריה של זרימה. בעזרת אסטרטגיית ה-gating המוצגת לראווה, ניתן לחקור רמות 2n, 4n, 8n ורמות גבוהות יותר של פלואידית הפטוציטים בכבדים קפואים בארכיון כדי להבין טוב יותר את התפקיד של הטרוגניות תאית בתפקוד רקמות1 (איור 3A). יתר על כן, ניתן לכמת את המורפולוגיה הגרעינית, כולל הגודל והנפח, באמצעות ציטומטריה של זרימת הדמיה כדי לתאם שינויים בגודל הגרעין עם שינויים במספר הכולל של ספירות או במספר הגנים בהתאם לרמת הפלואידים (איור 3B,C).
מדידת אומיקה רב-מודאלית מציעה את ההזדמנות לחקור מספר שכבות של ארגון גנומי בו זמנית. הגישה המולטיומית המשותפת RNA + ATAC מאפשרת לחקור את הרגולטורים במעלה הזרם וגנים מטבוליים במורד הזרם, ומספקת גישה מקיפה לחקר רשתות שעתוק וארכיטקטורת הכרומטין הקשורה לתפקוד הכבד ברזולוציה של תא בודד. יתר על כן, עם ההתקדמות בשיטות חישוביות שיכולות להסביר את דלילות הנתונים ואת הירידה בעלויות הריצוף, מולטיומיקה חד-תאית היא חלוצה בהערכה של מספר אופנים מאותו תא. פרוטוקול בידוד זה בעל גרעין יחיד תואם להערכה פרטנית ומשותפת של מערכי נתונים של ביטוי וכרומטין. השתמשנו בצינורות סטנדרטיים שנקבעו על ידי Stuart et al.23 (חבילת Signac) כדי להמחיש את איכות הנתונים, בעוד שניתן לאמץ בקלות מספר שיטות חישוביות זמינות וחלופיות לניתוחים במורד הזרם23,39,40,41.
באופן כללי, מולטיומיקה של גרעין יחיד מאפשרת לחקור רקמות כבד של פרימטים בארכיון ביולוגי, עכברי FF, בני אדם ולא אנושיים תוך שימוש בכמות קטנה מאוד של חומר דגימה התחלתי על ידי יישום פרוטוקול מיצוי הגרעין המוצג כאן. כלי רב ערך זה יסמיך ביולוגים של הכבד לחקור הן את ביטוי הגנים והן את נגישות הכרומטין בהקשר של פתולוגיות כבד שונות. בנוסף, רמות שונות של פלואידית הפטוציטים וההתאמה הנובעת מכך של ביטוי גנים בהתאם למיקומם באונה הכבד עשויות לחשוף את תפקידם בפאתולוגיות הכבד. לכן, אנו צופים כי חקירת ההטרוגניות התאית תספק הזדמנויות חדשות לפיתוח רפואה מדויקת והתערבויות ממוקדות נגד מחלות כגון HCC ו- NAFLD.

גנומיקה חד-תאית הופכת במהירות למתודולוגיה חיונית לחקר תפקוד הכבד ולהערכת ההשפעה של הטרוגניות תאית במצבי בריאות ומחלות1. ההתפתחות המהירה של "מולטיומיקה" למדידה סימולטנית של שכבות מידע שונות וההתרחבות המקבילה של צינורות חישוביים חזקים סוללת את הדרך לגילוי סוגי תאים ותת-סוגים שלא היו ידועים קודם לכן בכבד הרגיל והחולה2.
האפשרות לחקור ביו-בנקים ודגימות קפואות בארכיון הגדילה באופן משמעותי את ההזדמנויות לבחון מחדש ולגלות את תפקידם של תאים שאינם פרנכימליים 3,4,5 ולחקור את תפקידם של הפטוציטים פוליפלואידים במהלך ההזדקנות ובמחלות כרוניות 6,7,8,9 . לכן, מאמר זה מתאר פרוטוקול בידוד חזק וניתן לשחזור של גרעין יחיד עבור כבדים ארכיוניים קפואים (FF) התואם לריצוף RNA בגרעין יחיד במורד הזרם ולריצוף ATAC, כמו גם לאומיקה רב-מודאלית (RNA-seq משותפת ו-ATAC-seq) (איור 1).
תהליך עבודה זה מאפשר לחקור את התעתיק ואת נגישות הכרומטין של כל סוגי התאים בכבד, ללא תלות בגודל התא או בשבריריותו, בפרוטוקולי דיסוציאציה אנזימטית. זה יכול להתבצע עם קטעי רקמות קטנות (15-30 מ"ג או 5-10 מ"מ3) מדגימות אנושיות יקרות ערך או עכברים מהונדסים. קביעת הטוהר הגבוה של בידוד הגרעינים כוללת כימות ומדידה של גודל הגרעין, אשר עשוי להיות בקורלציה עם הגדלת גודל התא וסנסנציה 10,11, וטוהר זה רלוונטי לניתוח הן של פלואידית הפטוציטים 12 והן של מנגנוני שעתוק תלויי גודל התא11,13,14,15 . בנוסף, גרעינים שבודדו מכבדים קפואים שומרים מידע רב ערך על ייעוד הכבד. זרימת העבודה ואיסוף הרקמות מאפשרים אימות של נתוני גנומיקה חד-תאית או ניתוחים משלימים נוספים, כגון אימונוהיסטוכימיה או תעתיק מרחבי מאותה רקמה ומאותו אדם. לכן, גישה זו יכולה להיות מיושמת על מחלות כבד מרובות ואורגניזמים מודל באופן שיטתי ואמין.

<table><tbody><tr><td>10% טווין 20 - 5 מ"ל</td><td>Bio-Rad</td><td>1662404</td><td></td></tr><tr><td>2100 מכשיר ביו-אנלייזר</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>דבק PCR סרט תרמו</td><td>פישר מדעי</td><td>AB0558</td><td></td></tr><tr><td>ביו-אנלייזר ניתוח DNA ברגישות גבוהה</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>C1000 מגע Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td></td></tr><tr><td>סדרן</td><td></td><td></td> תאים <td>למיון תאים המופעל על ידי פלואורסנסציה (FACS); למשל BD FACSAria Cell Sorter.</td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5430R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000619</td><td>שימוש מקורר בטמפרטורה של 4 מעלות; </td></tr><tr><td>בקר כרום C & ערכת אביזר GEM הבאה</td><td>10X גנומיקה</td><td>1000204</td><td></td></tr><tr><td>כרום הבא GEM שבב G ערכת תא יחיד</td><td>10X גנומיקה</td><td>1000127</td><td></td></tr><tr><td>כרום הבא GEM שבב J ערכת תא יחיד, 16 תגובות</td><td>10X גנומיקה</td><td>1000230</td><td></td></tr><tr><td>כרום הבא GEM תא יחיד 3' ערכת v3.1, 4 תגובות</td><td>10X גנומיקה</td><td>1000269</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + חבילת ריאגנטים לביטוי גנים, 4 תגובות</td><td>10X גנומיקה</td><td>1000285</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, קוקטייל מעכב פרוטאז ללא EDTA</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>דיתיותרייטול (DTT) תמיסת 1M</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>646563</td><td>הכינו תמיסת מלאי של 1 מ"מ והשתמשו ב-1 &micro; M ריכוז סופי.</td></tr><tr><td>DNA AWAY משטח Decontaminant</td><td>Thermo Fisher Scientific 10223471</td><td></td><td>לנגב משטחים ופיפטות לפני תחילת הניסוי</td></tr><tr><td>DNA LoBind Tubes, 1.5 מ"ל</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16628742</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind Tubes, 2.0 מ"ל</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16638742</td><td></td></tr><tr><td>Elution Buffer (EB) - 250 מ"ל</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer C</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13527550</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer C אביזר: Smartblock</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13518470</td><td></td></tr><tr><td>אתנול, אבסולוט (200 הוכחה), דרגת ביולוגיה מולקולרית - 100 מ"ל&nbsp;</td>מסנני <td>10517694</td><td></td> <td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>50 ומיקרו; M, סטרילי&nbsp; &nbsp;</td><td>SYSMEX PARTEC - CELLTRICS</td><td>04-004-2327</td><td>התאם את קוטר המסנן בהתאם לגודל הרקמה והגרעינים</td></tr><tr><td>גליצרין (גליצרול), 50% (v/v) - 1 ליטר</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3290-32</td><td></td></tr><tr><td>מעטפת קשה, 384 בארות PCR צלחות PCR, דופן דקה, חצאית, ביו-ראד שקוף/לבן</td><td></td><td>HSP3905</td><td></td></tr><tr><td>Herenz Heinz ABS מלקחיים</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>1131884</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342, טריהידרוכלוריד, טריהידרט, תמיסה של 10 מ"ג/מ"ל במים</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>ציטומטר</td><td></td><td></td> זרימת הדמיה רגיש <td>לאור לניתוח ציטומטריית זרימת הדמיה, למשל Luminex Amnis ImageStream</td></tr><tr><td>Invitrogen TE Buffer - 100 מ"ל</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11568846</td><td></td></tr><tr><td>KCl (2 מ'), ללא RNase, 100 מ"ל</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9640G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (1 מ'), 100 מ"ל</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp רצועת 8-Cap, שקוף-300 רצועות</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10209104</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp רצועת 8 צינורות, 0.2 מ"ל-125 רצועות</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10733087</td><td></td></tr><tr><td>M&ouml; rser 2 מ"ל DOUNCE</td><td>Wagner & Munz GmbH</td><td>9651632</td><td>RNase zap ושטוף עם MillQ לפני השימוש</td></tr><tr><td>MyFuge 12 Mini MicroCentrifuge C1012</td><td>Benchmark</td><td>Scientific C1012</td><td>או כל מיני צנטריפוגה אחרת של רצועה וצינור</td></tr><tr><td>Neubauer Hemocytometer</td><td>OMNILAB&nbsp; LABORZENTRUM</td><td>5435293</td><td>לדמיין ולספור גרעינים תחת מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>מים נטולי נוקלאז (לא מטופל על ידי DEPC)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep Density Gradient Medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטה RT LTS 1000 ומיקרו; L, Wide-O</td><td>מטלר טולדו</td><td>30389218</td><td></td></tr><tr><td>פיסטיל "A" 2 מ"ל</td><td>וגנר & Munz GmbH&nbsp;</td><td>9651621</td><td>RNase לשטוף ולשטוף עם MillQ לפני השימוש</td></tr><tr><td>Pistill "B" 2 מ"ל</td><td>Wagner & Munz GmbH</td><td>9651627</td><td>RNase zap ושטוף עם MillQ לפני השימוש</td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה פוליפרופילן 15 מ"ל</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10579691</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי פוליסטירן, 60 מ"מ x 15 מ"מ</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10634141</td><td></td></tr><tr><td>פוליסטירן עגול תחתון 5 מ"ל צינורות FACS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10100151</td><td></td></tr><tr><td>Protector מעכב RNase - 2,000 U</td><td>Sigma אולדריץ'</td><td>3335399001</td><td>לשמור ב-20 מעלות; C עד לשימוש</td></tr><tr><td>מעכב RNase מבוסס חלבון SUPERase &bull; ב (20 U/&mu; L)</td> <td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>AM2696</td><td>שמור ב -20 מעלות; C עד לשימוש</td></tr><tr><td>מעכב RNase רקומביננטי</td><td>Clontech Takara</td><td>2313B</td><td>שמור ב -20 & מעלות; C עד השימוש</td></tr><tr><td>בצינורות מיקרופוגה ללא RNAse - 0.5 מ"ל</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase Decorrosion</td><td>Solution Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td>נגב משטחים ופיפטות לפני תחילת הניסוי</td></tr><tr><td>SPRIselect - 60 מ"ל</td><td>Beckman Coulter</td><td>B23318</td><td>Aliquot ואחסן ב -4 מעלות; C</td></tr><tr><td>סוכרוז, 500 גרם</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S0389-500G</td><td>הכינו פתרון מלאי של 1 M</td></tr><tr><td>אזמלי נירוסטה סטריליים חד פעמיים Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>11798343</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCI (1M), pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15568025</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100, 98%, 100 מ"ל</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10671652</td><td>הכינו תמיסת מלאי של 10%. שמור על 4 מעלות; C ולהגן מפני אור.</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11538886</td><td></td></tr><tr><td>מערבולת- מערבל</td><td>VWR</td><td>444-1372</td><td>או כל סוג אחר של מערבולת</td></tr></tbody></table>

בידוד גרעינים מרקמת כבד קפואה עבור מולטיומיה חד-תאית

Isolation of Nuclei from Flash-Frozen Liver Tissue for Single-Cell Multiomics

הכבד הוא רקמה מורכבת והטרוגנית האחראית על ביצוע פונקציות פיזיולוגיות קריטיות רבות, כגון שמירה על הומאוסטזיס אנרגיה ומטבוליזם של קסנוביוטיקה, בין היתר. משימות אלה מבוצעות באמצעות תיאום הדוק בין תאים פרנכימליים בכבד לבין תאים שאינם פרנכימליים. בנוסף, פעילויות מטבוליות שונות מוגבלות לאזורים ספציפיים של אונת הכבד - תופעה הנקראת ייעוד כבד. ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות ריצוף של תאים בודדים אפשרה לחוקרים לחקור הטרוגניות של רקמות ברזולוציה של תא יחיד. ברקמות מורכבות רבות, כולל הכבד, פרוטוקולי דיסוציאציה אנזימטיים ו/או מכניים קשים יכולים להשפיע לרעה על הכדאיות או על האיכות של התרחיפים החד-תאיים הדרושים לאפיון מקיף של איבר זה בבריאות ובמחלות.
מאמר זה מתאר פרוטוקול חזק וניתן לשחזור לבידוד גרעינים מרקמות כבד קפואות בארכיון. שיטה זו מניבה גרעינים באיכות גבוהה התואמים לגישות אומיקה חד-תאית במורד הזרם, כולל RNA-seq בעל גרעין יחיד, בדיקה לכרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ריצוף בתפוקה גבוהה (ATAC-seq), כמו גם אומיקה רב-מודאלית (RNA-seq משותפת ו-ATAC-seq). שיטה זו שימשה בהצלחה לבידוד גרעינים מדגימות כבד קפואות של בני אדם, עכברים ופרימטים שאינם בני אדם בריאים וחולים. גישה זו מאפשרת בידוד בלתי משוחד של כל סוגי התאים העיקריים בכבד, ולכן מציעה מתודולוגיה איתנה לחקר הכבד ברזולוציה של תא בודד.

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד גרעינים מרקמות כבד מוקפאות בהבזק, בארכיון עבור RNA-seq, ATAC-seq ומולטיומיקה של מפרקים (RNA-seq ו-ATAC-seq).

The liver is a complex and heterogenous tissue responsible for carrying out many critical physiological functions, such as the maintenance of energy ...

פרוטוקול קל וניתן לשחזור זה שימש בהצלחה לבידוד גרעינים באיכות גבוהה מכבדי מודל עכברים בריאים וחולים, כמו גם כבדים מפרימטים אנושיים ולא אנושיים. שיטה זו דורשת רק כמות קטנה של חומר רקמה קפואה. כמו כן, תמריץ כיתה צפיפות נותן השעיה גרעינית נקייה מאוד עם כל סוגי התאים העיקריים בכבד נשמר בהכנה הגרעינית הסופית.שיטה זו של מיצוי גרעינים יכולה לשמש בדגימות כבד אנושיות בארכיון ביולוגי המאוחסנות בביו-בנקים. התחילו את הומוגניזציה של הרקמה על ידי חיתוך קובייה של 2230 מיליגרם או חמישה מילימטרים מרקמת כבד שהונחה בצלחת פטרי על קרח יבש באמצעות אזמל מקורר מראש. מעבירים מיד את צלחת הפטרי לקרח רטוב ומוסיפים מיליליטר אחד של חיץ הומוגניזציה.באמצעות אזמל קר, טחון את הרקמה ככל האפשר, ומאפשר לו לשאוף עם קצה פתח רחב מיליליטר אחד. לאסוף את ההשעיה רקמה ולהעביר אותו מראש מקורר שני מיליליטר זכוכית dounce Homogenizer. לשטוף את צלחת פטרי עם עוד 0.521 מיליליטר של חיץ הומוגניזציה ולאסוף את כל חתיכות הרקמה הנותרות תוך שמירה על הכל על קרח.לאט ובזהירות לבצע חמש משיכות עם מזיק A רופף על קרח מבלי ליצור בועות. ודא כי המזיק נע בזהירות מהחלק העליון לתחתית של ההומוגנייזר עם כל שבץ. לאחר מכן בצע 10 עד 15 משיכות איטיות עם מזיק B הדוק על קרח מבלי ליצור בועות.לאחר שתסיים, סנן את ההומוגנט דרך מסננת תאים של 50 מיקרומטר תוך העברתו לצינור מקורר מראש של 1.5 מיליליטר. השתמש ביותר ממסנן או צינור אחד עבור הומוגנטים המכילים כמות גבוהה של גושי רקמת חיבור. שטפו את ההומוגנייזר ואת המסננים עם 0.521 מיליליטר נוסף של חיץ הומוגניזציה כדי לאסוף ביסודיות את כל ההומוגנטים של הרקמה לפני הצנטריפוגה של שיפוע הצפיפות.עבור צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות, צנטריפוגה את ההומוגנט המסונן בצנטריפוגה בעלת זווית קבועה מקוררת מראש ב-1000 G למשך שמונה דקות בארבע מעלות צלזיוס. בזמן שהדגימה עוברת צנטריפוגה, הכינו צינור 1.5 מיליליטר המכיל 250 מיקרוליטרים של דילול 50% יודיקסנול וצינור אחד של שני מיליליטר המכיל 500 מיקרוליטרים של 29% דילול יודיקסנול. מניחים את שני הצינורות על קרח.לאחר מכן מן ההשעיה צנטריפוגה, לשאוף את supernatant מבלי להפריע את הכדור באמצעות משאבת ואקום. השהה מחדש את הכדור ב-250 מיקרוליטרים של חיץ הומוגניזציה באמצעות קצה פיפטה ברוחב מיליליטר אחד. לאחר מכן מעבירים 250 מיקרוליטרים מתרחיף הגרעינים לצינור 1.5 מיליליטר מקורר מראש המכיל 250 מיקרוליטרים של 50% יודיקסנול ומערבבים אותו בעדינות וביסודיות כדי ליצור תרחיף גרעיני יודיקסנול 25%.לאחר מכן, העבר 500 מיקרוליטרים של מתלה גרעיני 25% יודיקסנול לתוך צינור מיליליטר צינור מקורר מראש המכיל 500 מיקרוליטרים של 29% דילול יודיקסנול. צנטריפוגה את הצינור בצנטריפוגת דלי מתנדנדת מקוררת מראש ב 12, 500 גרם למשך 20 דקות, כאשר ההפסקה יוצאת לדרך. רגע לפני השלמת שלב הצנטריפוגה, הוסיפו את מעכבי ה-RNA למאגר אחסון הגרעינים, או NSB תוך כדי התקדמות לצינורות ריצוף ה-RNA של הגרעין היחיד.לאחר השלמת הצנטריפוגה, לשאוף את supernatant מבלי להפריע את הכדור באמצעות משאבת ואקום. השהה בעדינות מחדש את הכדור ב-100 עד 300 מיקרוליטרים של NSB באמצעות קצה הפיתיון ברוחב מיליליטר אחד והעבר את תרחיף הגרעינים לצינור 1.5 מיליליטר נקי מקורר מראש. ספרו את הגרעינים באמצעות תמיסת טריפאן כחולה עם המוציטומטר ידני והשתמשו מיד במתלה הגרעינים המתקבל לבדיקת הגנומיקה של גרעין יחיד.למיון תאים מבוסס ציטומטריה של זרימה, סנן את תרחיף הגרעינים דרך מסנן של 50 מיקרומטר לתוך חמישה מיליליטר פלואורסצנטיים מקוררים מראש המופעלים על ידי מיון תאים או צינור פקס. השתמש בממיין ציטומטריה של זרימה המצויד בזרבובית של 100 מיקרומטר וטען את צינור הפקס על הסדרן לפני תצוגה מקדימה של הדגימה. הגדר את אסטרטגיית הפיזור למיון הגרעינים, החל משער פיזור על ידי התוויית אזור הפיזור הקדמי לעומת אזור הפיזור הצדדי, לאחר מכן גובה מתיחה לעומת אזור מתיחה, ולאחר מכן רוחב מתיחה לעומת אזור מתיחה.דמיינו את פרופיל הגרעינים על ההיסטוגרמה של האזור המתיחה. למיון ל-96 או 384 לוחות באר, הגדר את השהיית הטיפות ומטב את יישור הלוחות בשיטה colormetric. הגדר את קירור הדגימה ואת מחזיק הצלחת לארבע מעלות צלזיוס כאשר סיבוב הדגימה מופעל במהירות של 300 סל"ד.מיין את הגרעינים הבודדים בריכוז דגימה של בערך פי 10 לגרעינים החמישים למיליליטר עם קצב זרימה של 200 עד 500 אירועים בשנייה. הבדיקה המיקרוסקופית של הגרעינים שהופקו מכבדים קפואים הראתה כי שלב הצנטריפוגה של שיפוע הצפיפות הקל מאוד על הסרת פסולת תאית ורקמות לא רצויה. מתודולוגיה זו שימרה את כל רמות הפלואידיה, אשר אומתה וכומתה על ידי ניתוח ציטומטרי.מדדי איכות גבוהים נצפו מהנתונים שהתקבלו באמצעות מיצוי גרעינים. קירוב סעפת אחיד והקרנה ייצגו את מספר הספירות בכל הגרעינים וסוגי התאים העיקריים, אשר ניתן לזהות בביטחון רק עם תעתיק גרעיני וריצוף רדוד יחסית. גישה זו אפשרה לחקור גורמי שעתוק ספציפיים לכבד וגני מטרה במורד הזרם המעורבים בחילוף החומרים של קסנוביוטיקה.התבנית המשלימה של גנים סימן היכר כגון, CYP2E1 הפריצנטרי והפריפורטל CYP2F2 הראתה כי הגרעינים שחולצו שמרו מידע קריטי על תרומת כבד. ספריית ביטוי הגנים של RNA רוצפה לעומק של 44, 600 קריאות לכל גרעין וספריית ATAC לעומק של 43, 500 קריאות לכל גרעין. ניתוח משוקלל של השכן הקרוב ביותר שבוצע עבור מדידות מרובות של שני האופנים, RNA בתוספת ATAC, תוך שימוש בחבילות Seurat ו- Signac איפשר זיהוי וביאור של סוגי תאי הכבד העיקריים והמינוריים ללא הטיות בולטות עקב גודל התא או שבריריות גרעינית.בשיטה זו זוהו גם מווסתי השעתוק במעלה הזרם והגנים המוכרים של תרומת כבד. חשוב להימנע מיצירת בועות רבות מדי במהלך ההומוגניזציה של מטה בעת הזזת המזיקים למעלה ולמטה, ולהיצמד למספר המשיכות המצוין בפרוטוקול.

isolation-nuclei-from-flash-frozen-liver-tissue-for-single-cell

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול לבידוד גרעינים בודדים מרקמת גליומה טרייה קפואה. הגרעינים הבודדים יכולים לשמש כדגימות לטכניקות ריצוף כגון ריצוף RNA של גרעינים בודדים (snRNA) ובדיקת גרעינים בודדים לריצוף כרומטין נגיש טרנספוזאז (snATAC) כדי לקבל תובנות עמוקות יותר לגבי הטרוגניות בין ותוך גידולים שנצפתה בגליומה של רקמות העצבים המרכזיות.

בידוד גרעינים מרקמות גליומה טריות קפואות: שיטה להשגת גרעינים שלמים מדגימות גידולי גליומה

פרסום זה מתאר פרוטוקול לבידוד של גרעינים מאדיפוציטים בוגרים, טיהור על-ידי מיון המופעל באמצעות קרינה פלואורסצנטית ורמת תא בודדת מופעלת.

בידוד של שאדיפוז של גרעיני הרקמה עבור יישומים גנומית של תא יחיד

בידוד גרעיני בודד מסתמך על חדירות הדיסוציאציה וחומרי הניקוי המבוססים על קרום התא, צעדים הזקוקים לאופטימיזציה ונוטים להציג חפצים טכניים. אנו מדגימים כביסה ופרוטוקול ללא אנזים לבידוד מהיר של גרעינים שלמים ישירות מרקמות שלמות, מניב גרעינים מתאים לגרעין בודד RNA-seq (snRNA-Seq) או ATAC-seq.

גרעיני בידוד מרקמות שלמות באמצעות ניקוי ושיטה נטולת אנזימים

הטרוגניות תוך-גידולית היא תכונה אינהרנטית של גידולים, כולל גליומות. פיתחנו פרוטוקול פשוט ויעיל המשתמש בשילוב של חוצצים וצנטריפוגה הדרגתית כדי לבודד גרעינים בודדים מרקמות גליומה קפואות טריות למחקרי רצף גרעין יחיד ו- ATAC.

בידוד גרעינים מגידולים טריים במוח קפוא ל-RNA-seq חד-גרעיני ו-ATAC-seq

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד גרעינים איכותיים מכליות עכבר קפואות המשפרים את ייצוג סוגי תאי הכליה המדולריים ומונעים את ביטוי הגנים מדיסוציאציה אנזימטית של רקמות.

בידוד גרעינים מכליה של עכבר בוגר לריצוף RNA של גרעין יחיד

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר הכנת גרעיני תאים. לאחר מיקרודיסקציה ודיסוציאציה אנזימטית של רקמת הלב לתאים בודדים, תאי האב הוקפאו, ולאחר מכן בידוד של תאים טהורים בני קיימא, ששימשו לריצוף RNA של גרעין יחיד ובדיקת גרעין יחיד לכרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ניתוחי ריצוף בתפוקה גבוהה.

בידוד גרעינים מתאי אב לבביים של עכברים עבור אפיגנום ופרופיל ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד

המחקר מתאר פרוטוקול פשוט, מהיר ואוטומטי חלקית לבידוד גרעינים איכותיים מרקמות יונקים קפואים לצורך ריצוף RNA של גרעינים בודדים במורד הזרם.

פרוטוקול פשוט, מהיר ואוטומטי חלקית לבידוד גרעינים בודדים מרקמות יונקים קפואים לצורך ריצוף גרעין יחיד

ההצלחה של תעתיק חד-תאי/חד-גרעיני ומולטי-אומיקה תלויה במידה רבה באיכות התאים/גרעינים. לכן, בידוד תאים/גרעינים מרקמה וטיהורם חייבים להיות סטנדרטיים ביותר. פרוטוקול זה מתאר את הכנת הגרעינים מהמוח וממח העצם לבדיקת מולטיום-גרעינים חד-גרעיניים במורד הזרם.

הכנה איכותית של גרעיני מוח ומח עצם לבדיקות מולטיום של גרעינים בודדים

הפרוטוקול מספק גישה אמינה ואופטימלית לבידוד גרעינים מדגימות גידולים מוצקים לצורך ריצוף מולטיומי באמצעות פלטפורמת 10x Genomics, כולל המלצות לתנאי דיסוציאציה של רקמות, שימור בהקפאה של תרחיפים חד-תאיים והערכה של גרעינים מבודדים.

בידוד גרעינים אופטימלי מדגימות גידול מוצק טרי וקפוא לריצוף מולטיומי

אנו מתארים פרוטוקול לחילוץ גרעינים באיכות גבוהה מסוגי תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים בהקפאה, סטרומה/אנדותל ותאי דם שמקורם בהקפאה, לתמיכה בניתוחי ריצוף של הדור הבא של גרעין יחיד. ייצור גרעינים שלמים באיכות גבוהה הוא הכרחי לניסויים מולטיומיים, אך יכול להוות חסם כניסה לשטח עבור מעבדות מסוימות.

בידוד גרעיני מתאי דם שמקורם בהקפאה חוץ גופית

למדו פרוטוקול לבידוד גרעינים מרקמת כבד קפואה באמצעות צנטריפוגציה בגרדיאנט צפיפות. השיטה שומרת על רמות פלואידיות ומגוון סוגי תאים לניתוח RNA-seq ו-ATAC-seq בודד-גרעיני.

בידוד גרעינים מרקמת כבד קפואה עבור מולטיומיה חד-תאית

גלה סרטונים נוספים