Name: בידוד תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעיני חזיר גינאה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 6 s
Description: למד שיטה פשוטה ויעילה לבידוד תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעיני חזיר גינאה צעיר. השיטה מייצרת דגימות RPE באיכות גבוהה המתאימות למחקרים מולקולריים וניתוחי ביטוי גנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי האגודה היפנית לקידום המדע בחו"ל (S.G.), חוקר פוסט-דוקטורט ע"ש לוריס ודייוויד ריץ' (S.G.), ומענק מהמכון הלאומי לעיניים של המכונים הלאומיים לבריאות (R01EY012392; סי' פ"ו).

כל הטיפול בבעלי חיים והטיפולים ששימשו במחקר זה תאמו את הצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה. פרוטוקולי הניסוי אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת קליפורניה בברקלי.
1. חינוך עין השרקן
<ol><li>המתת חסד של שרקן עם הזרקה תוך לבבית של נתרן pentobarbital מועבר תחת הרדמה (5% isoflurane בחמצן).</li>
	<li>לחנך את העיניים בעזרת מלקחיים ומספריים, ומיד להעביר אותם לצלחת פטרי 10 ס"מ עם מלח סטרילי פוספט חוצץ (PBS) לשטיפה. העבירו את העיניים לתמיסת PBS טרייה. הערה: צלחת 6 בארות המכילה 4 מ"ל תמיסה לכל באר מומלצת.</li>
</ol>2. בידוד של העין האחורית העין וקומפלקס RPE/כורואיד/סקלרה
<ol><li>בעזרת מיקרוסקופ מנתח, השתמשו במחט 18G כדי לבצע חתך קטן ראשוני בסקלרה, בערך 1.0 מ"מ מאחורי גבול הגפיים (כלומר, בין הקרנית לסקלרה) (איור 1A); לאחר מכן השתמש במספריים כדי להסיר את החלק הקדמי, כולל הקרנית, הקשתית, הגוף הריסי והעדשה הגבישית.</li>
	<li>לאחר מכן, בעבודה עם העין הנותרת של מקטע העין האחורי, לנתק את הרשתית מקומפלקס RPE/choroid/sclera; השתמשו במלקחיים כדי לתפוס תחילה ואז למשוך בעדינות בזונולה של, ואז לקלף בהדרגה את הרשתית ללא פיצול (איור 1B). הערה: אין לתפוס את הרשתית ישירות כדי למנוע פיצול רשתית ובידוד רקמת רשתית חלקי. השימוש במיקרוסקופ חיוני לשלב דיסקציה זה.</li>
</ol>3. בידוד RPE מהכורואיד
<ol><li>לאחר הסרת הרשתית לחלוטין, טבלו את העין האחורית הנותרת, הכוללת את RPE, כורויד וסקלרה, בריאגנט אחסון רקמות למשך 5 דקות (ראו טבלת חומרים). הערה: השתמש בצלחת של 12 בארות עם בארות מזוהות, שכל אחת מהן מלאה ב- 2 מ"ל של מגיב אחסון הרקמות.</li>
	<li>מעבירים את העין לבאר אחרת מלאה ב-4 מ"ל PBS למשך 10 שניות לפני שמעבירים אותה לבאר שלישית מלאה ב-2 מ"ל PBS.</li>
	<li>חבר מחט 30 גרם למזרק 1 מ"ל מלא PBS לשלב הבידוד הסופי של RPE. לדחוף בעדינות על המזרק כדי ליצור זרם סילון של PBS; ראשית, כוונו את הזרם הזה אל ה-RPE כדי ליצור בו קרע קטן או חור, ואז כוונו את זרם PBS לתוך הפתח שנוצר כדי לנתק את ה-RPE כיריעה מהכורואיד (איור 1C). הערה: הניתוק של RPE כגיליון מניב את מדגם RPE הגדול ביותר. שוב, השימוש במיקרוסקופ חיוני לשלב זה.</li>
	<li>לאחר ניתוק ה-RPE מהכורואיד (איור 1D), אספו את רקמת ה-RPE במזרק 1 מ"ל ללא מחט, ולאחר מכן העבירו את הדגימה שנאספה לצינור של 1.5 מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגה את הצינור בנפח 1.5 מ"ל עם RPE שנאסף ב-8,000 × גרם למשך דקה אחת כדי לקבל גלולת RPE (איור 2A).</li>
	<li>השליכו את תמיסת PBS והחליפו אותה ב-350 מ"ל של חיץ ליזיס, כפי שנכלל בערכות בידוד RNA (ראו טבלת חומרים); פיפטה 20x לערבב, ובכך לשמור על איכות המדגם. לאחסון ושימור לטווח ארוך יותר, העבירו את הדגימות למקפיא בטמפרטורה של 80°C-. הערה: מאגר הליזה הוא רכיב קנייני של ערכת בידוד RNA עבור ליזה של תאים ורקמות לפני בידוד RNA ובידוד RNA/DNA/חלבון בו זמנית. כדי להשבית את הרנ"א בליזט, הקפד להוסיף β-מרקפטואתנול למאגר הליזיס (10 מיקרוליטר של β-מרקפטואתנול לכל 1 מ"ל של חיץ ליזיס).</li>
</ol>4. מיצוי RPE-RNA
<ol><li>השתמש בערכת בידוד RNA (ראה טבלת חומרים) כדי לבודד ולאסוף את הרנ"א מדגימות RPE בהתאם להוראות היצרן שסופקו. להעריך את איכות הדגימה באמצעות אלקטרופורזה. הערה: הפרוטוקול המתואר הניב מוצר באיכות טובה (כלומר, מספר שלמות RNA [RIN] מעל 8.0).</li>
</ol>

<ol><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li>
<li>Amram, B., Cohen-Tayar, Y., David, A., Ashery-Padan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigmented+epithelium+-+from+basic+developmental+biology+research+to+translational+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The retinal pigmented epithelium - from basic developmental biology research to translational approaches.</a> The International Journal of Developmental Biology. 61 (3-4-5), 225-234 (2017).</li>
<li>Goto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+retina-specific+Aldh1a1+controls+dorsal+choroidal+vascular+development+via+Sox9+expression+in+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Neural retina-specific Aldh1a1 controls dorsal choroidal vascular development via Sox9 expression in retinal pigment epithelial cells.</a> Elife. 7, 32358(2018).</li>
<li>Rymer, J., Wildsoet, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+retinal+pigment+epithelium+in+eye+growth+regulation+and+myopia%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of the retinal pigment epithelium in eye growth regulation and myopia: A review.</a> Visual Neuroscience. 22 (3), 251-261 (2005).</li>
<li>Wallman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+the+retina%3A+Choroidal+modulation+of+refractive+state%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Moving the retina: Choroidal modulation of refractive state.</a> Vision Research. 35 (1), 37-50 (1995).</li>
<li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scleral+hypoxia+is+a+target+for+myopia+control%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Scleral hypoxia is a target for myopia control.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (30), 7091-7100 (2018).</li>
<li>Troilo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imi+-+Report+on+experimental+models+of+emmetropization+and+myopia%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Imi - Report on experimental models of emmetropization and myopia.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (3), 31-88 (2019).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Violet+light+suppresses+lens-induced+myopia+via+neuropsin+%28OPN5%29+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Violet light suppresses lens-induced myopia via neuropsin (OPN5) in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), e2018840118(2021).</li>
<li>Zhang, Y., Wildsoet, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPE+and+choroid+mechanisms+underlying+ocular+growth+and+myopia%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+Biology+and+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">RPE and choroid mechanisms underlying ocular growth and myopia.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 221-240 (2015).</li>
<li>Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration.</a> New England Journal of Medicine. 358 (24), 2606-2617 (2008).</li>
<li>McLeod, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+RPE+and+choriocapillaris+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Opthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Relationship between RPE and choriocapillaris in age-related macular degeneration.</a> Investigative Opthalmology and Visual Science. 50 (10), 4982(2009).</li>
<li>Bhutto, I., Lutty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+age-related+macular+degeneration+%28AMD%29%3A+Relationships+between+the+photoreceptor%2Fretinal+pigment+epithelium%2FBruch%27s+membrane%2Fchoriocapillaris+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Understanding age-related macular degeneration (AMD): Relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex.</a> Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).</li>
<li>Shelton, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+choroid%2FRPE+gene+expression+in+marmoset+eyes+undergoing+changes+in+ocular+growth+and+refraction%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of choroid/RPE gene expression in marmoset eyes undergoing changes in ocular growth and refraction.</a> Molecular Vision. 14, 1465-1479 (2008).</li>
<li>Wang, S., Liu, S., Mao, J., Wen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+retinoic+acid+on+the+tight+junctions+of+the+retinal+pigment+epithelium-choroid+complex+of+guinea+pigs+with+lens-induced+myopia+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effect of retinoic acid on the tight junctions of the retinal pigment epithelium-choroid complex of guinea pigs with lens-induced myopia in vivo.</a> International Journal of Molecular Medicine. 33 (4), 825-832 (2014).</li>
<li>He, L., Frost, M. R., Siegwart, J. T., Norton, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+gene+expression+in+tree+shrew+retina+and+retinal+pigment+epithelium+produced+by+short+periods+of+minus-lens+wear%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Altered gene expression in tree shrew retina and retinal pigment epithelium produced by short periods of minus-lens wear.</a> Experimental Eye Research. 168 (3), 77-88 (2018).</li>
<li>Nickla, D. L., Wallman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifunctional+choroid%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The multifunctional choroid.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 144-168 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., Liu, Y., Wildsoet, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional%2C+optical+sign-dependent+regulation+of+BMP2+gene+expression+in+chick+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Bidirectional, optical sign-dependent regulation of BMP2 gene expression in chick retinal pigment epithelium.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (10), 6072-6080 (2012).</li>
<li>Xin-Zhao Wang, C., Zhang, K., Aredo, B., Lu, H., Ufret-Vincenty, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+for+the+rapid+isolation+of+RPE+cells+specifically+for+RNA+extraction+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Novel method for the rapid isolation of RPE cells specifically for RNA extraction and analysis.</a> Experimental Eye Research. 102 (1), 1-9 (2012).</li>
<li>Goto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+signatures+of+contact+lens-induced+myopia+in+guinea+pig+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Opthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Gene expression signatures of contact lens-induced myopia in guinea pig retinal pigment epithelium.</a> Investigative Opthalmology and Visual Science. 63 (9), 25(2022).</li>
<li>De Schaepdrijver, L., Simoens, P., Lauwers, H., De Geest, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+vascular+patterns+in+domestic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Retinal vascular patterns in domestic animals.</a> Research in Veterinary Science. 47 (1), 34-42 (1989).</li>
<li>Araki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base-resolution+methylome+of+retinal+pigment+epithelial+cells+used+in+the+first+trial+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-based+autologous+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Base-resolution methylome of retinal pigment epithelial cells used in the first trial of human induced pluripotent stem cell-based autologous transplantation.</a> Stem Cell Reports. 13 (4), 761-774 (2019).</li>
<li>Sonoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).</li>
<li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

במאמר זה נתאר שיטה לבידוד RPE, המתאימה לניתוח ביטוי גנים של RPE, מעיניהם של שרקנים צעירים בעלי פיגמנטים. היתרונות של פרוטוקול זה הם שהוא מניב דגימות RPE באיכות גבוהה שהן יחסית חופשיות מזיהום, עם RNA שנשמר כראוי לניתוחים ספציפיים ל-RNA, ועם זאת, הוא פשוט ויעיל יחסית. בעוד שבדוגמה המובאת כאן, דגימות RPE נאספו מעיניו של שפן ניסיונות צעיר (בן שבועיים), הפרוטוקול שימש בהצלחה גם לאיסוף דגימות RPE מבעלי חיים מבוגרים (בוגרים צעירים).
עבור חוקרים עם ניסיון קודם מינימלי עם ניתוח עיניים או דיסקציה, פרוטו...

RPE מורכב משכבה ייחודית של תאים פיגמנטיים הממוקמים בין הרשתית העצבית לבין כורואיד כלי הדם, ול- RPE תפקידים מוכרים היטב בפיתוח ותחזוקה של תפקוד רשתית תקין, כולל פוטוטרנסדוקציה 1,2. לאחרונה, RPE הוקצה תפקיד מפתח נוסף בוויסות צמיחת העין3, ובכך התפתחות קוצר ראייה4. משימה זו מבוססת על המיקום הקריטי של ה-RPE, המשולב בין הרשתית לכורואיד ועל ההסכמה הרחבה כיום שצמיחת העין, ולכן שגיאות שבירה, מווסתות באופן מקומי5. ה-RPE ממלא תפקיד מפתח כממסר אותות, המקשר בין הרשתית, המקור המשוער של אותות מודולריים לגדילה, לכורואיד ולסקלרה, שתי המטרות של האותות המועברים 6,7,8.
העלייה באורך הציר המאפיינת את רוב קוצר הראייה אינה יכולה להיחשב שפירה, כאשר שינויים פתופיזיולוגיים המערבים את הרשתית, כורואיד ו / או סקלרה מייצגים תוצאות בלתי נמנעות וכעת מוכרות היטב של התארכות עיניים מוגזמת 7,9. בהקשר זה, RPE הוא אולי הפגיע ביותר, שכן, בהיותה רקמה לא מיטוטית, היא מסוגלת להכיל רק את חדר הזגוגית המתרחב על ידי מתיחה ודילול של תאים בודדים. בעוד שתפקידו בפתולוגיות הקשורות לקוצר ראייה, כגון ניוון מקולרי קוצר ראייה, עדיין לא הובן במלואו, RPE היה מעורב בפתוגנזה של מספר מחלות רשתית אחרות, כולל ניוון גיאוגרפי, אחד הגורמים המובילים לעיוורון, הקשור להפרעות מתועדות ברשתית, RPE, וכורואיד10,11, 12.
הבידוד המוצלח של תאי RPE, ללא זיהום מרקמות עיניים סמוכות, עשוי לפתוח הזדמנויות מחקר רבות להשגת תובנות חדשות לגבי המנגנונים העומדים בבסיס מגוון מחלות עיניים/רשתית. עם זאת, הבידוד של RPE הוכח כמאתגר, כאשר מחקרים רבים שפורסמו עשו שימוש בדגימות רשתית / RPE משולבות או RPE / כורואיד מסיבה זו13,14,15. מחקרים הכרוכים בבידוד מוצלח של RPE באיכות המתאימה ללימודי ביולוגיה מולקולרית הוגבלו לעיני אפרוחים ועכבר16,17. לדוגמה, שיטת בידוד RPE וייצוב RNA בו זמנית (SRIRS) שתוארה על ידי וואנג ואחרים 18. כדי לבודד תאי RPE בעכברים לא נראה לעבוד טוב בעיני שרקן. הפרוטוקול המתואר כאן מייצג חידוד של גישה שבתחילה יוצרה אבטיפוס עם עיני חורש עצים על ידי אחד המחברים (M.F.) והוכחה כמניבה דגימות RPE באיכות גבוהה, המתאימות לניתוח RNA וביולוגיה מולקולרית אחרת, מעיניהם של שרקנים צעירים בעלי פיגמנט19.

<table><tbody><tr><td>מזרק 1 מ"ל עם קצה החלקה</td><td>Bd Vacutainer Labware רפואי</td><td>22-253-260</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות 6 באר עם מכסה, תחתית שטוחה,</td><td>חזה סטרילי כימי Mfg. Corp</td><td>970-95008</td><td></td></tr><tr><td>12 צלחת תרבית רקמות באר עם מכסה, אינדיבידואלית, סטרילית</td><td>תומאס סיינטיפיק LLC</td><td>1198D72</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td></td><td></td><td>אלקטרופורזה אוטומטית לבדיקת איכות RNA</td></tr><tr><td>פתרונות מלח מאוזנים</td><td>Gibco</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>בון מיקרו מלקחיים, ישר חלק, קצה 0.3 מ"מ, 7 ס"מ</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>11083-07</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים של Dumont מס' 5</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>מחטים חד פעמיות היפודרמיות</td><td>Exelint International, Co.</td><td>26419</td><td></td></tr><tr><td>מחטים חד פעמיות היפודרמיות</td><td>Exelint International, Co.</td><td>26437</td><td></td></tr><tr><td>MiniSpin Microcentrifuges</td><td>Eppendorf</td><td>540108</td><td>מקסימום מהירות: 8,000 גרם</td></tr><tr><td>RNAlater פתרון ייצוב</td><td>Invitrogen</td><td>AM7020</td><td>מגיב לאחסון רקמות</td></tr><tr><td>RNeasy Mini ערכות</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>ערכת בידוד RNA סטודנטים</td></tr><tr><td>ואנאס מספריים אביב</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>91500-09</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעיני חזיר גינאה

Isolation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Guinea Pig Eyes

פרוטוקול זה מתאר את בידוד התאים של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) מעיניהם של שרקנים צעירים בעלי פיגמנט לצורך יישום פוטנציאלי במחקרי ביולוגיה מולקולרית, כולל ניתוח ביטוי גנים. בהקשר של ויסות גדילת העין וקוצר ראייה, RPE ככל הנראה ממלא תפקיד כממסר תאי לאותות מודולריים לגדילה, שכן הוא ממוקם בין הרשתית לשני קירות העין, כגון כורואיד וסקלרה. בעוד פרוטוקולים לבידוד RPE פותחו הן עבור אפרוחים והן עבור עכברים, פרוטוקולים אלה הוכיחו כי אינם ניתנים לתרגום ישיר לשרקן, שהפך למודל קוצר ראייה חשוב ונפוץ של יונקים. במחקר זה נעשה שימוש בכלים של ביולוגיה מולקולרית כדי לבחון את הביטוי של גנים ספציפיים כדי לאשר שהדגימות היו נקיות מזיהום מהרקמות הסמוכות. הערך של פרוטוקול זה כבר הוכח במחקר RNA-Seq של RPE משרקנים צעירים בעלי פיגמנט שנחשפו לקוצר ראייה אופטי הגורם לקוצר ראייה. מעבר לוויסות גדילת העיניים, לפרוטוקול זה יש יישומים פוטנציאליים נוספים במחקרים על מחלות רשתית, כולל מקולאופתיה קוצרת ראייה, אחד הגורמים המובילים לעיוורון במיופים, שבהם RPE היה מעורב. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה יחסית ולאחר שהשתכללה, מניבה דגימות RPE באיכות גבוהה המתאימות ללימודי ביולוגיה מולקולרית, כולל ניתוח RNA.

ניתוח דגימות RPE שנאספו באמצעות הפרוטוקול לעיל הראה רנ"א שמור היטב (RIN &gt;8.0, איור 2B), עם 240.2 ננוגרם ± 35.1 ננוגרם לעין (n = 8, NanoDrop, איור 2B). כדי להעריך עוד יותר את איכות דגימות ה-RPE המבודדות, ובמיוחד את היעדר המזהמים הכורואידיים והסקלרליים, בחנו את ביטוי הגנים המייצגים של כל אחת מהרקמות האחרונות בדגימות RPE19. דגימות RPE הדגימו ביטוי גבוה משמעותית של Rpe65 (גן ספציפי ל-RPE) בהשוואה לרמות הביטוי של Rpe65 בכורואיד וב...

אנו מתארים שיטה פשוטה ויעילה לבידוד תאים של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) מעיניהם של שרקנים צעירים בעלי פיגמנט. הליך זה מאפשר מעקב אחר מחקרי ביולוגיה מולקולרית על RPE המבודד, כולל ניתוח ביטוי גנים.

This protocol describes the isolation of cells of the retinal pigment epithelium (RPE) from the eyes of young pigmented guinea pigs for potential ...

אפיתל פיגמנט ברשתית או RPE הוא קריטי לבריאות הרשתית. וחקר RPE המבודד הוא חיוני למחלת הרשתית. שיטה זו של בידוד RPE מהשרקן, מודל קוצר ראייה פופולרי, מסייעת בפתרון הבעיה המאתגרת.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה יחסית ומניבה דגימת RPE באיכות גבוהה המתאימה למחקרים המולקולריים הביולוגיים כולל ניתוח RPE. על ידי ביצוע מושלם של הטכניקה שהודגמה והתבוננות כיצד לתפעל את כלי הניתוח, ניתן לשלוט בהליך זה במהירות עם קצת תרגול. לאחר המתת חסד אנושית של השרקן וחניכת עיני החיה, שטפו מיד את העיניים על ידי העברתן לצלחת פטרי בגודל 10 ס"מ המכילה מלח חוצץ פוספט סטרילי או PBS.לאחר שטיפה, להעביר את העיניים לתמיסת PBS טרייה. כעת עובדים תחת מיקרוסקופ מנתח, השתמשו במחט של 18 מד כדי ליצור פתח קטן ראשוני בלובן העין של עין אחת, כמילימטר אחד מאחורי הגבול הגפיים בין הקרנית לסקלרה. בעזרת מספריים, הסר את החלק הקדמי, כולל הקרנית, הקשתית, הגוף הריסי והעדשה הגבישית.לאחר מכן עבודה עם מקטע עיני אחורי שנותר, השתמש במלקחיים כדי לתפוס ולמשוך בעדינות על הזונולה של, ולאחר מכן לנתק את הרשתית מקומפלקס RPE/choroid/sclera, ולקלף את הרשתית ללא פיצול. לאחר הסרת הרשתית לחלוטין, טבלו את העין האחורית הנותרת, הכוללת את RPE, כורויד וסקלרה באחת הבארות של צלחת בת 12 בארות המכילה שני מיליליטר של מגיב אחסון רקמות והשאירו אותה שקועה במשך חמש דקות. כדי לשטוף את מגיב האחסון, העבירו את העין לבאר אחרת מלאה בארבעה מיליליטר PBS למשך 10 שניות לפני העברתה לבאר שלישית מלאה בשני מיליליטר PBS.לפני שתמשיך לשלב הבידוד הסופי של RPE, הכינו מזרק של מיליליטר מלא PBS וחברו מחט של 30 מד. לחץ בעדינות על בוכנה מזרק כדי ליצור זרם סילון של PBS. בעבודה תחת מיקרוסקופ, ראשית, לכוון את הזרם הזה של PBS על RPE כדי ליצור קרע קטן או חור בו.לאחר מכן כוון את זרם PBS לתוך הפתח שנוצר כדי לנתק את RPE כמו יריעה מן choroid. לאחר ניתוק ה-RPE מהכורואיד, אספו את תאי ה-RPE במזרק של מיליליטר אחד ללא מחט והעבירו את הדגימה שנאספה לצינור של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינור עם RPE שנאסף ב 8, 000 x גרם במשך דקה אחת כדי לקבל גלולת RPE.כדי שדגימות ישמשו בניתוחי RNA, השליכו את הסופרנטנט, כלומר תמיסת PBS, והחליפו אותו ב-350 מיליליטר של חיץ ליזיס כפי שנכלל בערכות בידוד RNA. בצע פיטום של התוכן למעלה ולמטה 20 פעמים כדי לערבב היטב ולשמור על איכות הדגימה. לאחסון ושימור לטווח ארוך, מעבירים את הדגימות למקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס.השתמש בערכת בידוד RNA ופעל לפי הוראות היצרן כדי לבודד ולאסוף את ה- RNA מדגימות RPE לפני הערכת איכות הדגימה באמצעות אלקטרופורזה. במחקר שלנו, דגימות RPE שנאספו הראו RNA שמור היטב בעל מספר שלמות RNA או RIN גדול משמונה. ספירת RNA כוללת של כ-240 ננוגרם לעין.רמת הביטוי של הגן הספציפי RPE, Rpe65, נמצאה גבוהה משמעותית בדגימות RPE מאשר בכורואיד וסקלרה. לעומת זאת, דגימות RPE הראו ביטוי מינימלי של הגן הספציפי לובן העין הכורואידי שנבחר, קולגן מסוג אלפא-אחד, מה שמצביע על היעדר מזהמים כורואידיים וסקלרליים בדגימות RPE המבודדות. השלב החשוב ביותר של ההליך הוא הסרה חלקה של הרשתית מבלי להשאיר מאחור כל קטע רשתית.הליך בידוד RPE זה מצדיק הסבר מחקרי תרבית תאים חוץ גופית עם כמה הבדלים חשובים, כולל בחירת המדיה לטבילה של תאי RPE לאחר הבידוד.

isolation-of-retinal-pigment-epithelial-cells-from-guinea-pig-eyes

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון זה אנו מראים הליך להשגת תאי אפיתל פיגמנט עיני ממודל ארנב. התאים מסייעים בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות למחלות ניווניות ברשתית.

בידוד תאי IPE ו-RPE: טכניקה להשגת תאי אפיתל פיגמנט עיני מעין ארנב

בסרטון זה אנו מתארים טכניקה לבידוד תאי אפיתל קשתית ופיגמנט רשתית מעיני חזירים כדי להשיג את התרביות הראשוניות שלהם למחקרי in vivo ו- ex vivo. תאי פיגמנט אלה יכולים להיות מהונדסים גנטית כדי לחקור גישות רגנרטיביות לטיפול בהפרעות עיניים.

בידוד תאי IPE ו-RPE: טכניקה להשגת תאי אפיתל פיגמנטיים מעין חזירית מבודדת

סרטון זה מדגים את ההליך לבידוד אפיתל פיגמנט הרשתית, או RPE, תאים ותאי אפיתל פיגמנט קשתית, או IPE, מעיני בקר שנקטפו. ניתן לגדל את התאים המבודדים בתרבית כדי לחקור את תפקידם בטיפול במחלות עיניים.

בידוד תאי RPE ו-IPE מעין בקר: הליך לקציר ותרבית תאי אפיתל פיגמנטיים ראשוניים של בקר

כאן מוצג פרוטוקול לבידוד וזיהוי תאי אפיתל ראשוניים של איריס ושל פיגמנט רשתית מיונקים שונים (עכברים, חולדות, ארנב, חזיר וחזירים). השיטה מתאימה באופן אידיאלי לחקר גישות ריפוי גנטי עיניות במגוון סטים עבור ניתוחי ex vivo ובמחקרי vivo הניתנים להעברה לבני אדם.

בידוד, תרבות והנדסה גנטית של תאי אפיתל פיגמנט ראשוני של יונקים לטיפול גנטי לא ויראלי

כתב יד זה מתאר פרוטוקול פשוט לבידוד תאי אפיתל פיגמנטציה ברשתית (RPE) מעיני עכבר באופן מדורג. הפרוטוקול כולל אנוקליזציה ונתיחה של עיני עכבר, ולאחר מכן בידוד, זריעה והתרבות של תאי RPE.

בידוד של תאי אפיתל פיגמנטים ברשתית של עכברים ראשוניים

פרוטוקול זה מתאר את ההליך להשגה וטיפוח של תאי אפיתל פיגמנט רשתית ראשוניים (RPE) מעיניים חזיריות ממקור מקומי. תאים אלו מהווים חלופה איכותית לתאי גזע ומתאימים למחקר רשתית במבחנה .

בידוד תאי אפיתל פיגמנט רשתית חזיריים ראשוניים למידול חוץ גופי

אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE) פועל כמחסום מכריע בין הכורואיד לרשתית, ומקדם את בריאותם ותפקודם של סוגי תאי רשתית, כגון פוטורצפטורים. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול פשוט ויעיל לבידוד וטיפוח RPE של מורין בוגר.

שיטה פשוטה לבידוד ותרבית של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעכברים בוגרים

בסרטון זה נדגים כיצד לבודד בתאי גזע הרשתית מן אפיתל ריסי העין העכבר לגדל אותם בתרבית כדי ליצור כדורים רשתית משובט. התחומים כי הם מבודדים להחזיק את המאפיינים העיקריים של בתאי גזע: התחדשות עצמית multipotentiality.

בידוד של גזע תאים רשתית העין של העכבר

הדרך המהירה, החזקה של בידוד קיימא גזע בוגרים לתאי האפיתל של העור האנושי הוא תיאר. השיטה משתמשת עיכול אנזימטי של מטריקס הקולגן בעור, ואחריו מריטת זקיקי השיער ובידוד של המתלים תא בודד או שברי רקמה תרבית תאים.

בידוד תרבות למבוגרים גזע תאים אפיתל של העור האנושי

ציוץ הוא טכניקה חדשנית ומהירה למפות אתרי הקישור הגנומי של RNAs noncoding ארוכות (lncRNAs). השיטה מנצלת את הייחודיות של תחושת אנטי oligonucleotides ריצוף כדי לאפשר ספירה של lncRNA הנכנס אתרים הגנומי.

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

למד שיטה פשוטה ויעילה לבידוד תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעיני חזיר גינאה צעיר. השיטה מייצרת דגימות RPE באיכות גבוהה המתאימות למחקרים מולקולריים וניתוחי ביטוי גנים.

בידוד תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעיני חזיר גינאה

גלה סרטונים נוספים