ב Vivo הדמיית סידן של תגובת נוירוני גרעיני השורש הגבי לגירויים סומטיים וקרביים

המחקר שלנו מתמקד בתאי העצב ובמעגלים של המערכת הסומטוסנסורית המעורבים בתיאור ההשפעות משככות הכאבים של דיקור סיני על כאב קרביים תוך ניסיון להתאים את תגובות הנוירונים של נוירו-DRG לגירויים של דיקור. שיטות מסורתיות, כגון הקלטה חשמלית, אינן יכולות לבחון ביעילות את מספרי התאים המספיקים ואת הקשרים התאיים הספציפיים המובהקים כדי לזהות את הנוירונים המגיבים הקרביים או הסומטיים in vivo. חקר התפקידים התפקודיים של נוירון DRG בהשפעה משכך כאבים של דיקור סיני היה קשה בגלל אילוצים טכנולוגיים.

הצגנו גישה כללית לבחינת האחריות של נוירון DRG מספר שש לסימולציה תוך קולית ודיקור סיני in vivo. הפרוטוקול מתאר את הנהלים להתבוננות בפעילות של נוירוני DRG in vivo בתגובה לקלט סומטי וקרביים. זהו שיפור לעומת המחקר הקודם, שהתמקד רק בסקר תגובות נוירונים ב-L5 DRG תחת הגירויים הסומטיים.

בעתיד, עם ההגדרה הנכונה, ניתן לבצע הדמיית DRG in vivo CAS במקטעים של בית החזה או צוואר הרחם, ולספק כלי חזק יותר לחקר השפעות הכאב והדיקור הקרביים. שיטה זו חיונית לחוקרי דיקור סיני ללמוד. כדי להתחיל, הנח את העכבר עם קנה הנשימה במצב נוטה על כרית החימום.

בצע חתך בקו האמצע באורך שבעה סנטימטרים בגב התחתון והאריך אותו מהמותני החמישי לחוליות העצה הראשונות. לאחר מכן, הזיזו בזהירות הצידה את שרירי הלונגיסמוס המותניים כדי לחשוף את התהליכים הקוצניים של שלוש החוליות. הזיזו את החלקים הפנימיים של שרירי עמוד השדרה המותני הדו-צדדי, שרירי עמוד השדרה המותני הגבי ושרירי עמוד השדרה המותני הגבי כדי לחשוף את שלושת התהליכים המפרקיים והחלקיים הרצופים עם קטע ההקלטה באמצע החוליות.

כעת, יש לשתק את החיה בצורה מאובטחת בעזרת מלקחיים בשיניים על התהליכים המפרקיים הדו-צדדיים של החוליות השכנות. השתמש במלקחיים כדי להסיר את התהליכים המפרקיים והחלקיים השמאלית או הימנית של ארבע או שש החוליות המותניות. חשוף בזהירות את המותני השמאלי או הימני שש DRG לאחר ניקוי רקמות החיבור שמעליו.

הקפד לשמור על האפינוריום שלם בצד הנבחר של שש החוליות המותניות. כסו את אזורי ה-DRG החשופים בכדורי צמר גפן קטנים ספוגים במי מלח כדי לשמור על המצב הפעיל. כעת, חבר את מערכת אספקת ההרדמה בזרימה נמוכה לצינורית קנה הנשימה כדי להחדיר את העכברים.

מקם את החיה עם ה-DRG החשוף על כרית חימום הממוקמת על הבמה של מהדק עמוד שדרה מותאם אישית. בעזרת שני מהדקים על עמודי השדרה של החוליות השכנות, אבטח את החיה כדי למזער את התנועה במהלך הבדיקה. לאחר מכן, החלף את כדורי הצמר גפן הרטובים במי מלח עד שאזור הניתוח נקי מספיק.

הכנס את מהדק עמוד השדרה המותאם אישית לשלב המיקרוסקופ המעוצב בהתאמה אישית. לצורך הדמיה, מקם עדשת אובייקט אוויר למרחק עבודה ארוך ממיקרוסקופ קונפוקלי מעל ה-DRG החשוף. לכוד ערימות Z בהילוך מהיר של המותני השלם ארבע או שש DRG עם 25 מיקרומטר לכל צעד ורזולוציה של 512 על 512 או 1, 024 על 1, 024 פיקסלים.

בצע סריקת XYZT של ה-DRG עם ארבע עד שמונה ערימות, הכוללות אחד עד שלושה מצבי בסיס, שניים עד שלושה גירויים של דיקור סיני או התרחבות המעי הגס הקרביים, ואחד עד שניים מצבים פוסט-גירויים. לאחר מכן, החל גירוי צחצוח או צביטה על הגב התחתון, הגפה האחורית או הכפה האחורית של החיה, כדי להעריך את שדה הקליטה הרגיש ביותר של נוירוני ה-DRG המצולמים. נהל גירויים לדיקור סיני באופן ידני או באמצעות נקודת דיקור וממריץ עצבי זמין מסחרית.

השתמש במתיחות המעי הגס עם מד לחץ אוויר מתוצרת עצמית כדי לגרום לגירויים קרביים. בעזרת מיקרוסקופ קונפוקלי, מדוד את העלייה בקרינה הירוקה של ה-GCaMP העצבי בעת קשירה לסידן תוך תאי בעקבות גירויים סומטיים או קרביים. באמצעות תוכנת הדמיה, הבהירו את הווידאו באמצעות אפשרות הצבע.

תיחום ידני של תאים גלויים ובדיקת גודל התא ועוצמת הקרינה היחסית. ביטוי עוצמת הקרינה כיחס בין העלייה בקרינה המעוררת המקסימלית לרמה הבסיסית. ששת הנוירונים המותניים של DRG בדרך כלל חסרים פלואורסצנטיות GFP בסיסית, אולי בהשפעת רמות ביטוי GCaMP ונזק כירורגי.

גירויים של התרחבות המעי הגס גרמו לעלייה מהירה וחולפת בפלואורסצנטיות GCaMP. תגובות דומות נצפו עם יישום דיקור חשמלי BL25. מפות חום ותרשימי קו הראו תגובות של כל הנוירונים המעוגלים למתיחות המעי הגס ולדיקור חשמלי BL25.

ההיסטוגרמה מציגה את הקוטר של נוירונים מגיבים למתיחות המעי הגס ולדיקור חשמלי BL25.