מודל קסנוגרפט אורגנואיד שמקורו בחולי סרטן הכבד כדי לחקור את ההשפעה של התחדשות הכבד על צמיחת הגידול

הישנות הגידול היא בעיה בולטת מאוד של כריתת לידה. במחקר זה, אנו מנסים להבין יותר על צמיחת הגידול בסביבה רגנרטיבית. הוכח כי אורגנואידים של גידול מסכמים את הגידול המטופל מבחינה היסטולוגית וגנטית, אם כי מודלים in vivo הם נדירים וחסרי יציבות.

הצלחנו להשתיל את האורגנואיד שמקורו בחולה בכבד של העכבר. הראינו זאת עבור שני מקרים לדוגמה. הצביעה האימונוהיסטוכימית ההיסטולוגית מראה כי האורגנואידים והקסנוגרפט דומים לגידול המקורי של המטופל.

התפתחות האורגנואידים מהגידול המקורי דומה למודל מדויק יותר של גידול מטופל בהשוואה לאפשרויות אחרות כמו תרביות תאים דו-ממדיות. הטמעת מודל זה בסביבה המורכבת של התחדשות הכבד תעזור להבין יותר על האינטראקציות הקיימות בין תאי הגידול לסביבה המתחדשת. אנו מקווים שנרכוש ידע בתחום שלנו לגבי הבנת ההישנות של HCC בכריתת הכבד.

לכן, במודל זה, אנו רוצים ליצור את הבסיס לפרויקטים מחקריים עתידיים. כדי להתחיל, השתמש באזמל ובמלקחיים כדי לחתוך את רקמת סרטן הכבד שנקטפה לשברים קטנים של מילימטר עד שני מילימטרים רבועים. העבירו את חלקי הרקמה לתוך צינור של 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של מאגר דיסוציאציה.

הנח את הצינור על מכשיר סיבוב בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, העבירו את תערובת התאים על מסננת תאים של 100 מיקרומטר המונחת על גבי צינור של 50 מיליליטר. השתמש בבוכנה של מזרק של חמישה מיליליטר כדי לרסק את שברי הרקמה דרך המסנן.

כעת הוסף חמישה מיליליטר של DMEM מתקדם בתוספת מעל המסנן כדי לשטוף אותו. העבירו את המסנן לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. לאחר שאיבת הסופרנטנט, השהה מחדש את הכדור בחמישה מיליליטר של מאגר ליזה של כדוריות דם אדומות.

צנטריפוגה שוב את המתלים למשך חמש דקות ב-300 גרם. לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של PBS לפני הספירה. לפני ציפוי התאים, הסר את הסופרנטנט מתרחיף תאי הצנטריפוגה.

השעו מחדש עם כמיליליטר אחד של מטריצת קרום המרתף לצינור והניחו על קרח. פיפטה 20 מיקרוליטר של תרחיף תאים לבארות של צלחת חמה מראש של שש בארות ליצירת טיפות. לאחר המתנה של שתיים-שלוש דקות, הנח את הצלחת במצב הפוך בארון זרימה למשך חמש דקות.

לאחר מכן העבירו את הצלחת לחממה להתמצקות. לבסוף, הוסף שני מיליליטר של מדיום תרבית אורגנואידים לכל באר. קו האורגנואידים שמקורו בחולה הציג מאפיינים מורפולוגיים של הגידול המקורי של החולה.

כדי להתחיל, הניחו עכבר מורדם במצב שכיבה כשהגפיים מודבקות כלפי מטה. השתמש במלקחיים ובמספריים מיקרו-כירורגיים כדי לבצע חתך באתר הניתוח המדולדל לאורך האלבה הליניארית מהבטן התחתונה לסחוס ה-xiphoid. הכנס את המחזירים לחתך, התאם את כיוון המתיחה כדי להשיג חשיפה אופטימלית של הבטן העליונה.

הניחו מפית נקייה שנרטבה במי מלח ממש ליד מקום החתך. כעת, הוציא את המעי הדק ואת הצקום על המפית הרטובה. חשוף את האונה העליונה הימנית עד שתתאפשר הזרקה.

משוך את תערובת האורגנואידים למזרק שטיפה המסומן המילטון. הזרקו בהתמדה את המתלה לעכבר עד לסימן מבלי להזיז את המחט. הפעל לחץ בעזרת צמר גפן על מקום ההזרקה.

לאחר מכן בדוק את הבטן אם יש קרע באונה או זרימה חוזרת. שוטפים את הבטן עם 0.5 מיליליטר מי מלח סטריליים. הניחו תפר ריצה עם תפר נספג לסגירת הבטן.

הגידול שהתפתח בעכבר דמה הן לאורגנואידים שמקורם בחולה והן לגידול המקורי של החולה. כדי להתחיל בכריתת כבד קלה, בצע לפרוטומיה על עכבר מורדם במצב שכיבה. בעזרת צמר גפן לח, דחוף את האונה המדיאלית לכיוון הגולגולת כדי ליצור יותר מקום בשדה הניתוח.

הפוך את אונת הכבד הצדדית השמאלית בגולגולת כדי לחשוף את האונה והרצועה הזנבית. חתוך את הרצועה לחלוטין. לאחר מכן הכנס קשירה מתחת לאונה הכבד הצדדית.

כעת הפוך את אונת הכבד הצדדית השמאלית בזנב והנח את הקצה החופשי השמאלי של הקשירה סביב הקצה השמאלי של אונת הכבד הצדדית השמאלית. הנח את הקצה החופשי הימני סביב הקצה השני. השתמש בצמר גפן כדי להפעיל מתיחה על האונה, וודא שהקשירה ממוקמת במרכז.

ואז קושרים חצי קשר כפול. אבטח את הקשר הזה עם קשר חצי שני נוסף קשור בכיוון השני מבלי להדק אותו במלואו. כאשר הקשירה ממוקמת כראוי, החזק את הקצה החופשי הגולגולתי של הקשירה בעזרת מלקחיים קהים ומשוך את הקצה הזנבי עם זוג מלקחיים נוסף.

אבטח את הקשר עם קשר שני קשור בכיוון ההפוך. חותכים קרוב לקשירה מבלי לחתוך אותה כדי לכרות את הכבד. לאחר הכריתה הקלה של אונת הכבד הצדדית השמאלית, יש לחצות את הרצועה הפלציפורמית.

הפוך את האונה בצורה גולגולתית, ואז הכנס קשירה מתחתיה והפוך אותה בזנב. כעת סובב את החלק החופשי של הקשירה סביב השפתיים. לאחר שהקשירה ממוקמת כהלכה, קשרו לאט חצי קשר כפול.

הדק לחלוטין קשר חצי שני בכיוון ההפוך, ואז הוסף קשר חצי שלישי בכיוון ההפוך. כרתו את האונה ואז שטפו את הבטן בתמיסת מלח סטרילית. החזירו את המעיים למקומם האנטומי.

כדי לסגור את הבטן, השתמש במלקחיים כדי לתפוס את העור והצפק. הניחו תפר עם תפר נספג בקצה העליון של קו החתך. בצע תפר שני בצד השני של החתך היוצא בצד העור.

קושרים את הקשר בחוזקה ומשאירים את הקצה החופשי ללא המחט קצרה. השאר את קצה המחט של התפר ארוך. סיים את תפר הריצה עם קשר בקצה התחתון של החתך.

נקה את הבטן מכל הדם שנותר. התרומה היחסית של אונות הכבד ניתנת להשוואה בין העכברים השונים מאותו הזן. המשקל הממוצע של האונה התחתונה הימנית עלה ל-0.82% ממשקל הגוף הכולל לאחר כריתה קלה.

כריתה גדולה הביאה לעלייה של 0.99% ממשקל הגוף הכולל. כריתה גדולה של האונה העליונה הימנית הביאה לעלייה ניכרת במשקלה ביחס לאונה התחתונה הימנית.