ניתוח מטבולומי של שעורה על ידי כרומטוגרפיה גזית/ספקטרומטריית מסה

מטרת מחקר זה היא לטפל בהשפעות הבצורת על החקלאות. ככל שהאקלים ממשיך להשתנות, יש עלייה בבצורת, ובצורת משפיעה על ביטחון תזונתי. מטבולומיקה חשובה כדי לזהות ולכמת את השפעת הבצורת על המזון שלנו.

אתגר גדול במטבולומיקה הוא השגת רמת ודאות גבוהה של תרכובות מזוהות. על ידי שימוש במתוקסיאמין במקום הידרוקסילאמין בשלב החמצון, שיפרנו את היעילות של שלב הסילילציה הבא מכיוון שקבוצת המטוקסי לא תגיב עם MSTFA. השיטות הנוכחיות להתבוננות בתגובות הצמח ללחץ סביבתי מתמקדות בתהליכים או ברקמות ספציפיות.

בעוד ששיטה זו אינטגרטיבית יותר על ידי זיהוי אותות כימיים בתוצר התבואה הסופי. בעתיד נרצה להשתמש בשיטה הזו כדי להבין כיצד בצורת וגידולים משולבים משפיעים על שעורה. שעורה היא דגן חשוב לביטחון תזונתי, ואנו רוצים להבין כיצד שינוי האקלים ישפיע עליה.

כדי להתחיל, טען 200 מיליגרם קמח שעורה למאגר ממס שלב מוצק, או SPE. משרים את הקמח עם 200 מיקרוליטר מתנול למשך 20 דקות להשרות. הסר את המתנול באמצעות אידוי בוואקום למשך 30 דקות.

עם הייבוש, חבר את העמוד לסעפת ואקום. חלץ רכיבים לא קוטביים חלק A עם דיכלורומתאן לבקבוקון של 10 מיליליטר, והפעל את סעפת הוואקום עד שהקמח יבש. לאחר מכן, הוסף תערובת של מתנול ומים נטולי יונים כדי לחלץ את מרכיבי הקוטב חלק B לבקבוקון של 10 מיליליטר.

הפעל את סעפת הוואקום עד שהקמח יבש. הוסף תקן 1 ותקן 2 לשבר A וערבב על ידי פיפטינג חוזר. מאדים את הממס במלואו בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי.

לאחר מכן ממיסים מחדש את הדגימה באתר מתיל טרט-בוטיל, או MTBE, לפני הוספת מתנול ונתרן מתוקסיד לבקבוקון. אפשר לטרנססטריפיקציה להמשיך במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר תוך ערבוב מגנטי. הוסף לתמיסה חומצה הידרוכלורית מימית.

מערבבים את התמיסה המחומצת עם דיכלורומתאן. אוספים את תכולת הבקבוקון בעזרת פיפטה פסטר ארוכה, ומאפשרים לשלבים להיפרד בפיפטה. שטפו את השלב האורגני על ידי הוספת חומצה הידרוכלורית מימית.

שוב, אספו את תכולת הבקבוקון בעזרת פיפטה פסטר ארוכה ואפשרו לשלבים להיפרד בפיפטה. מעבירים את השלב האורגני התחתון לבקבוקון חדש ומתאדים לייבוש באמצעות מאייד סיבובי. לאחר מכן, הוסף נתרן גופרתי נטול מים לעמודת SPE.

ממיסים את הדגימה המאודה בדיכלורומתאן וטוענים אותה על עמודת ה-SPE. יש להוציא את שבר 1 עם שלוש מנות של n-הקסאן ו-MTBE לבקבוקון של 10 מיליליטר. לאדות את התמיסה המכילה שבר 1 ליובש על מאייד סיבובי.

ממיסים מחדש את הדגימה ב-n-Hexane ומעבירים אותה לבקבוקון דגימה אוטומטית עבור GC/MS. לאחר מכן הוצא את קדם שבר 2 מעמודת ה-SPE עם שלושה חלקים עוקבים של n-Hexane ו-MTBE לבקבוקון של 10 מיליליטר. לאחר אידוי הקדם-שבר 2 ליובש, יש להמיס אותו מחדש בפירידין נטול מים ולהוסיף MSTFA.

בעזרת קשרי רוכסן, אבטח כפפת ניטרו מעל קצה המזרק כשהבוכנה מוסרת. מלאו את הבלון בארגון נטול מים והצמידו מחט חד פעמית למזרק. דחף את מזרק הבלון דרך מחיצת הבקבוק המכיל את המגיב נטול המים והכנס מזרק שני עם מחט ארוכה כדי לשאוב את הממס.

שטפו את בקבוקון הדגימה בזרם עדין של ארגון נטול מים. לאחר איטום הבקבוקון בפרפילם, הניחו אותו באמבט שמן של 70 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר הסילילציה, מצננים את חלק 2 בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות וטוענים אותו לבקבוקון דגימה אוטומטית.

הוסף את תקנים 3 ו-4 לשבר B וערבב על ידי פיפטינג חוזר ונשנה. העבירו שניים וארבעה מיליליטר של תערובת שבר B לבקבוקון חדש לעיבוד לשבר 3 ושבר 4 בהתאמה. התאדות לפני שבר 3 ליובש על מאייד סיבובי, ואחריו אידוי עם פירידין נטול מים.

ממיסים מחדש את הקדם-שבר 3 בפירידין נטול מים ומוסיפים טרימתיל-סילימידזול. שטפו את בקבוקון הדגימה בזרם עדין של ארגון נטול מים. לאחר איטום בקבוקון הדגימה עם פרפילם, יש לחמם למשך 20 דקות באמבט שמן של 70 מעלות צלזיוס.

לאחר קירור התמיסה לטמפרטורת החדר, הוסיפו n-הקסאן ומים נטולי יונים. מערבבים את התערובת ומעבירים את השלב האורגני העליון לבקבוקון דגימה אוטומטית בעזרת פיפטה פסטר ארוכה. אידוי טרום שבר 4 ליובש על מאייד סיבובי, ואחריו אידוי עם פירידין נטול מים.

ממיסים מחדש את הדגימה בפירידין נטול מים ומוסיפים מתוקסילאמין הידרוכלוריד. לאחר שטיפת הבקבוקון בארגון נטול מים, אוקסמט את הבקבוקון האטום למשך 30 דקות באמבט שמן של 70 מעלות צלזיוס. לאחר שהבקבוקון מקורר לטמפרטורת החדר, הוסיפו MSTFA וסילילט במשך 20 דקות באמבט שמן.

לאחר מכן, הוסף n-הקסאן ומים נטולי יונים לתוך הבקבוקון ואסוף את השלב המימי התחתון באמצעות פיפטה פסטר ארוכה. לאחר הכביסה האחרונה, אידוי השלב המימי ליובש באמצעות מאייד סיבובי ואחריו אידוי החומר הנותר עם אצטוניטריל נטול מים. ממיסים מחדש את הדגימה באצטוניטריל נטול מים ו-MSTFA.

לאחר שטיפת הבקבוקון בארגון נטול מים, מחממים את הבקבוקון האטום למשך 60 דקות באמבט שמן של 70 מעלות צלזיוס. טען דגימות על ה-GC/MS באמצעות נפחי ההזרקה שצוינו. הפעל את הדגימות בזרימה מפוצלת של 14 מיליליטר לדקה של הליום בטמפרטורת הזרקה של 250 מעלות צלזיוס.

עבור שברים 1 ו -2, רמפו את טמפרטורת העמודה מ -100 ל -300 מעלות צלזיוס בקצב של 4 מעלות צלזיוס לדקה. לאחר שהגעתם ל -300 מעלות צלזיוס, החזיקו את הטמפרטורה למשך 10 דקות. עבור שבר 3, מחממים ומחזיקים את העמוד על 300 מעלות צלזיוס למשך כל הריצה.

עבור שבר 4, הגדל את טמפרטורת העמודה מ-70 ל-142 מעלות צלזיוס ב-2.5 מעלות צלזיוס לדקה. החזק את הטמפרטורה על 142 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן העלו את הטמפרטורה מ -142 ל -235 מעלות צלזיוס ב -4 מעלות צלזיוס לדקה, והחזיקו למשך 10 דקות.

לבסוף, אופים את העמוד בחום של 320 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות.