In vivo Thoracic Horsal Root Ganglia (DRG) הדמיית סידן והקלטת א.ק.ג לחקר גירוי עצבי היקפי

מחקר זה הציג מניפולציה כירורגית לחשיפת DRG בית החזה בעכברים מורדמים להדמיית סידן in vivo יחד עם הקלטת אלקטרוקרדיוגרמה מסונכרנת. על ידי כך, אנו מנסים לענות על השאלה האם דיקור סיני ב-PC6 בנקב יכול להפעיל את נוירון DRG ולווסת בו זמנית את האלקטרוקרדיוגרמה. הטכניקות המשמשות כיום במחקרי דיקור כוללות אלקטרופיזיולוגיה in vivo או vitro, מעקב עצבי ואסטרטגיות שונות בשילוב עם אופטוגנטיקה וכימוגנטיקה.

הדמיית הסידן in vivo שהוצגה במחקר זה עוזרת להבין טוב יותר את הפעילויות של אוכלוסיות נוירונים DRG הנגרמות על ידי דיקור, הכל במודלים שונים של בעלי חיים, באמצעות הקלטות דינמיות ובזמן אמת. בשל העקמומיות הפיזיולוגית של עמוד השדרה החזי במקטעי חוליה של בית החזה אחד עד חמישה, די קשה לחשוף DRGs של בית החזה. חוץ מזה, ההשפעות של מקצבי הלב והריאות גורמות לקיבוע של DRGs בית החזה להיות מאתגר.

אחרת, הרדמה נשימתית ותחזוקת מצב העכברים במשך שעות אינן קלות. הדמיית סידן in vivo חושפת את פעילותן של אוכלוסיות נוירונים ספציפיות באמצעות עכברי הנדסה גנטית. זו הפעם הראשונה שנוירונים DRG של בית החזה נצפו in vivo.

גישה זו מממשת התבוננות בפעילויות עצביות המיוצרות על ידי גירויים סומטיים או קרביים, כמו גם את הדיבור ההדדי שלהם. המעבדה שלנו ביססה שיטות להדמיית סידן in vivo של DRG בית החזה והמותני, ובעתיד נסקור את הקולטנים הקשורים לגורמים יוזמים של דיקור, רגישות יתר, אינטראקציות בין גירוי דיקור סומטי ותשומות קרביים. לאחר ביצוע טרכאוטומיה על עכבר מורדם, הנח את העכבר במצב נוטה על כרית מחוממת.

בצע חתך אורכי של שני סנטימטרים במרכז העורף, המשתרע משש צוואר הרחם ועד שלוש חוליות בית החזה. הפרד בזהירות את בלוטות השומן ובלוטות החורף בהיבט הקדמי של חוליות בית החזה של העכבר, תוך הימנעות מכלי הדם שמתחת לבלוטות. השתמש במספריים קפיציים כדי לחתוך את שכבות העור והשרירים, כולל שריר הטרפז.

הכנס מפסק בין השרירים כדי לסייע בחשיפה נוספת. הסר את השרירים המחוברים למהדק הראש ואת החלק הישר של שרירי הצוואר הארוך, וחשוף את התהליכים הקוצניים של בית החזה שניים. עקור את שרירי הסמי-ספינליס והספינליס כדי לחשוף את קשת החוליות מ-C6 ל-T3. נתק את הקשר בין לוחית קשת החוליות לתהליך המפרקי של בית החזה.

השתמש במלקחיים עדינים כדי להסיר בקפידה את התהליכים המפרקיים השמאלי והימני ואת התהליכים היונקים של בית החזה. נקה את רקמת החיבור שמעליו. חשוף בזהירות את גנגליון השורש הגבי השמאלי או הימני, או DRG, והבטיח את שלמות האפינוריום בצד הנבחר.

הניחו צמר גפן קטן ספוג במי מלח חמים מעל ה-DRG החשוף כדי לשמור על הלחות. חבר את צג האק"ג עם הקוטב השלילי בגפה העליונה הימנית, חוט ההארקה בגפה התחתונה הימנית והקוטב החיובי בגפה התחתונה השמאלית. הנח את העכבר על הבמה של עמוד השדרה המותאם אישית clamp עם כרית חימום.

אבטח את העכבר באמצעות שני קליפסים המחוברים לתהליכים המפרקיים של צוואר הרחם שש ובית החזה שלוש. מקם את מהדק עמוד השדרה עם העכבר המאובטח מתחת למיקרוסקופ הקונפוקלי. הנח את מטרת האוויר למרחקים ארוכים 10x/0.32 מעל בית החזה החשוף 1 DRG.

הגדר את גודל הצעד ל -25 מיקרומטר ורזולוציה של 512 על 512 או 1, 024 על 1, 024 פיקסלים. כוונן את ציר ה-z של ה-stage למעלה ולמטה וללכוד את כל בית החזה 1 DRG. החל גירוי מברשת על הגפה העליונה של העכבר והעריך את ההיענות של נוירוני DRG המצולמים.

בצע גירויים עצביים היקפיים בגירוי PC6 באמצעות ממריץ. בתנאי הבסיס, רוב הנוירונים ב-DRG בית החזה 1 לא הפגינו פלואורסצנטיות GFP. גירוי סומטי הביא לעלייה מהירה וחולפת בפלואורסצנטיות GCaMP עם עלייה במספר ובעוצמת ה-GFP.

גירויים עצביים היקפיים ביישום PC6 הביאו לשינויים דומים בפלואורסצנטיות GCaMP כמו גירוי סומטי. הנוירונים סומנו וממוספרים בתוך DRG 1 בית חזה יחיד לאחר מעקב באמצעות תוכנת הדמיה. נוירונים המראים שינויים בעוצמת הקרינה העולים על 130% מסף F0 נחשבו לתגובות חיוביות.

ההיסטוגרמה הציגה את הקטרים השונים של נוירונים המגיבים לגירויים עצביים היקפיים ב-PC6. הגירויים העצביים ההיקפיים בגירוי PC6 הראו קצב לב מוגבר.