זיהום in vivo ו-In vitro של שורשי תפוחי אדמה בנמטודות טפיליות צמחיות להערכת שינויים מבניים מושרים

הפרוטוקול מתאר זיהום של שורשי Solanum tuberosum בנמטודות טפיליות של צמחים בתנאי חממה in vivo ושורשים טרנסגניים של תפוחי אדמה במבחנה לניתוח היסטוכימי של מבנה השורשים באמצעות מיקרוסקופיה אופטית.

מחקר על זיהומי נמטודות טפיליות בגידולים מושפע מהשונות של תנאי הסביבה, מה שיכול להשפיע באופן משמעותי על תוצאות הניסוי ועל שחזור הנתונים.

פיתחנו תרביות מבחנה של שורשים טרנסגניים של תפוחי אדמה עם נמטודות טפיליות צמחיות כחלופה אמינה שתופסת פחות מקום, דורשת פחות זמן להשגה, והיא נקייה מזיהום או משונות גנטית של המארח.

מעקב אחר ההתקדמות הזמנית של זיהום נמטודות בשורשי היבול נותר מאתגר. טכניקות צביעה דיפרנציאליות מספקות שיטה אמינה לזיהוי אתרי זיהום ולהבחנה מדויקת בין שלבי חיים של נמטודות.

בהשוואה לניסויי חממה, שורשים כבדים של תפוחי אדמה תומכים במערכת רציפה ובקרה למתן כל שלבי התפתחות הנמטודות, ללא תלות בשינויים עונתיים או אקלימיים.

אז הפרוטוקול המתואר מציע כמה יישומים עתידיים מבטיחים. לדוגמה, הוא מאפשר מחקרים מפורטים על המנגנונים המולקולריים והתאיים של מתן תובנות לגבי האופן שבו נמטודות טפיליות צמחיות מדביקות ומתמרנות מארחים.

[קריין] כדי להתחיל, יש לשטוף גזר מתחת למי ברז זורמים ואז עם תמיסת ניקוי נפוצה להסרת פסולת. לאחר ייבוש במגבת נייר, הכניסו שיפוד מתכת מעוקר לחלק העליון של הגזר, כסנטימטר עד שני סנטימטרים פנימה. בעזרת בקבוק כביסה המצויד בזרבובית, הרטיבו את הגזר עם 96% אתנול. כתם את הקצה התחתון של הגזר על נייר פילטר מעוקר. ואז העבירו אותו בזהירות דרך להבה. בעזרת קולפן סטרילי מקלפים את הגזר מלמעלה למטה וחוזרים על האש. לאחר השלכת החלקים העליונים והתחתונים, הניחו את החלק האמצעי בצלחת פטרי סטרילית. בעזרת להב סטרילי ופינצטה חותכים קטעים בעובי סנטימטר אחד. מעבירים את החלקים לצלחות פטרי סטריליות. לאחר איטום הצלחת, שמור אותה תחת אור UV למשך 60 דקות מכל צד לעיקור דיסקיות הגזר. דגרו על דיסקיות הגזר בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך למשך שבוע עד שבועיים. לאחר מכן, בעזרת להב סטרילי, בצע חתך בצורת X במרכז דיסק הגזר, וחתוך רק בעומק מחצית. פיפטה 50 מיקרוליטר של תרחיף נמטודות נגע שורש המכיל לפחות 50 שלבי חיים מעורבים לתוך החתך. לאחר איטום צלחת הפטרי, דגרו אותה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך עד שלושה חודשים. כדי לחלץ את נמטודות נגע השורש, העבירו את דיסקיות הגזר עם נמק גלוי למסננת רשת של 75 מיקרומטר בקוטר שמונה סנטימטרים המונחת בקערת זכוכית סטרילית. לאחר מכן, שפכו תמיסת אנטיביוטיקה על המסננת עד לכיסוי הדיסקים. לאחר דגירה של לילה בחושך, השתמש בפיפטה מעוקרת כדי להעביר את הנמטודות מתחתית הקערה לגוש כתמי זכוכית מעוקר. הכניסו מיליליטר אחד של תמיסת אנטיביוטיקה לתוך גוש הצביעה ותנו לנמטודות להתיישב במשך 30 עד 40 דקות. הוציאו את תמיסת האנטיביוטיקה המשומשת וחזרו על תהליך הכביסה ארבע עד חמש פעמים. השתמש מיד בתרחיף נמטודת נגע השורש, או אחסן בטמפרטורה של 11 מעלות צלזיוס. בחר פקעות תפוחי אדמה באותו גודל והשליך כל אחת עם חורים, חבורות או חלקים רכים. מלאו עציצים של חמישה ליטר בתערובת אחד לאחד של אדמת חיטוי וחול וערבבו פנימה 22.5 גרם דשן NPK בשחרור איטי. ואז זרעו את תפוחי האדמה בעומק של תשעה סנטימטרים מתחת לפני האדמה. מניחים את העציצים בחממה תחת 50 עד 70% לחות. השקה לעתים קרובות כדי לשמור על לחות הקרקע ב-70% מיכולת החזקת המים המקסימלית, תוך הימנעות מקיצוניות בטמפרטורה. לאחר שצמחי תפוחי האדמה הגיחו, צרו ארבעה עד שישה חורים מפוזרים באופן שווה סביב כל צמח כדי לראות עומק. פיפטה שמונה מיליליטר של תרחיף המכיל 30,000 נמטודות נגע שורש חיות בשלב החיים המעורבים לתוך החורים. לאחר מכן, מכסים את החורים בתערובת אדמה. לעציצי בקרה ועציצים המכילים נמטודות נגע שורש, יש למנוע השקיה ביום החיסון. לאחר חודשיים של תרבות, עקרו את צמחי תפוחי האדמה והפרידו את הקלעים והשורשים לשקילה. יש לשטוף בזהירות את מערכת השורשים. בדוק את השורשים של אתרי התקפת RLN באמצעות טכניקות צביעה מתאימות. מניחים פקעות תפוחי אדמה שטופות ומעוקרות בכלי. מכסים את הפקעות בתמיסת אקונומיקה מסחרית של 25%. סוגרים את המיכל ומערבבים למשך 15 דקות. לאחר השלכת האקונומיקה, שטפו את הפקעות שלוש פעמים במי ברז מעוקרים. לאחר מכן, במכסה המנוע, טבלו את הפקעות בתמיסת אתנול 80% למשך 15 דקות בתסיסה נמרצת. לאחר הוצאת האתנול, יש לשטוף שלוש פעמים במי ברז מעוקרים. בעזרת אזמל סטרילי, הסר את החלקים ההיקפיים של הפקעות. חתכו את החלק המרכזי הפנימי למקטעים בעובי 0.5 סנטימטר. כדי לחסן את החלקים, יש לערבב תחילה מיליליטר אחד של תרחיף ריזוגנס ריזוביום עם תשעה מיליליטר של מדיום SH. טובלים את קצה האזמל הסטרילי בתרחיף המדולל ופוצעים את פני פלחי תפוחי האדמה חמש פעמים. לאחר ייבוש הקטעים, הניחו אותם על מדיום SH מוצק למחצה ודגרו בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים בחושך כדי להקל על העברת הפלסמיד. בסוף היום השלישי, העבירו את המקטעים הנגועים לצלחות המכילות מדיום SH מוצק למחצה בתוספת אנטיביוטיקה. לאחר שלושה חודשים, השתמש בפינצטה סטרילית כדי לאסוף אשכול של גרם אחד של שורשים מהונדסים. העבירו את השורשים למרכז הצלחת עם מדיום SH טרי חצי מוצק ללא אנטיביוטיקה. כדי לאסוף את המוני ביצי הנמטודה, השג את עפצי השורש. השתמש בזוג פינצטה סטרילית עדינה במיוחד כדי לחלץ בזהירות מסות ביצים תחת מיקרוסקופ סטריאו דו-עיני המוגדר להגדלה של פי 20. מניחים את המוני הביצים בצלחת פטרי מכוסה המכילה חמישה מיליליטר מי ברז סטריליים ונותנים להם לבקוע במשך 48 שעות. לאחר מכן, במכסה המנוע, פיפטה חמישה מיליליטר ממתלה J2 המכיל 100 נמטודות למיליליטר על מסננת רשת של 20 מיקרומטר. לאחר שטיפה במי ברז סטריליים, טבלו את המחצית התחתונה של המסננת המכילה נמטודות J2 בתמיסת מי חמצן של 20%, וערבבו בתנועה סיבובית למשך 15 דקות. הוציאו מי ברז סטריליים דרך המסננת מעל הנמטודות, וחזרו על תהליך הכביסה פעמיים. הטה את המסננת כך שהנמטודות יתאספו בגבול במהלך הכביסה הסופית. לאחר מכן, פיפטה מיליליטר אחד של מים אולטרה-טהורים סטריליים מגבול המסננת כדי לשחזר את הנמטודות. במכסה המנוע, תת-תרבית גוש של גרם אחד של שורשים טרנסגניים של תפוחי אדמה על צלחות SH עם 100 נמטודות סטריליות. עקוב אחר התרבית המשותפת באופן קבוע תחת מיקרוסקופ הפוך בהגדלה של פי 100. כאשר מסת הביצים נראית לעין, תת-תרבית את השורשים לצלחת בינונית חדשה של SH. השימוש בדיסקיות גזר הביא לעלייה ממוצעת של פי 100 באוכלוסיות הנמטודות תוך שלושה חודשים. צמחי תפוחי אדמה לא הראו תסמינים נראים לעין תחת מספרי אוכלוסיית נמטודות נגע שורש נמוך. מספר שלבי חיים של Pratylenchus penetrans נצפו בקליפת השורש לאחר צביעה בפוקסין חומצי, מה שמצביע על חדירת הרקמה והנגעים הנמקיים הנלווים נראו בבירור באזורים נגועים. התפתחות שורשים טרנסגניים של תפוחי אדמה הראתה צמיחה ראשונית של מסת תאים לאורך פצעים שנגרמו על ידי אזמל בקטע פקעת תפוחי האדמה, ואחריה הופעת שורשים טרנסגניים. צמיחה מתמשכת של השורשים נצפתה במצע התרבות וגושי השורשים הועברו בהצלחה למצע גידול טרי להמשך צמיחה. תרביות שורש טרנסגניות של תפוחי אדמה נדבקו בהצלחה בצעירים בשלב השני של Meloidogyne chitwoodi כדי להקים תרביות משותפות של נמטודות צמחים. עפצי שורש המכילים נקבות בוגרות והמוני ביצים נצפו בתרבויות הנגועות. רקמות מרה שנוצרו על ידי Meloidogyne chitwoodi נראו לאחר הדבקה של שורשי תפוחי אדמה טרנסגניים עם שלבים מובהקים של התפתחות ורבייה של נמטודות הניתנות לזיהוי, כולל היווצרות מסות ביצים וביצים.