ב Vivo יישום של תיוג קירבה מבוסס TurboID ב-Drosophila melanogaster

במחקר זה, תיוג קרבה מבוסס TurboID משמש למיפוי האינטראקציות של חלבוני קישואים בתאי קו הנבט של שחלת דרוזופילה. זוהו אינטראקציות ידועות וחדשניות של קישואים. יש לציין כי מספר אינטראקטורים חדשים נמצאו מעורבים בקיפול החלבון, ארגון הממברנה והסחר הפיזי. במחקר זה, TurboID משמש לתיוג יעיל ברקמות בעלי חיים תוך שליטה בביוטינילציה ברקע. ספציפיות התיוג וכיסוי החלבון משופרים על ידי אופטימיזציה של בקרות והעשרת פפטידים ביוטיניים לאחר טריפסיניזציה. גישה זו מאפשרת סינון מערכתי של אינטראקציות חלבונים כדי לחשוף את הפונקציות והמנגנונים המולקולריים של חלבונים מעניינים.

[קריין] כדי להתחיל, מרחו כף מעבדה של רסק שמרים חלק שהוכנו על ידי המסת אבקת שמרים במים מזוקקים משולשים על דופן הבקבוקון. קח בקבוקון נוסף המכיל זבובים שזה עתה בקעו והקש עליו בעדינות כדי לאסוף את הזבובים בתחתית. הפוך את הבקבוקון הזה על הבקבוקון המכיל את משחת השמרים ויישר את החישוקים כדי למנוע בריחת זבובים. הקש על שני הבקבוקונים יחד כדי להעביר את הזבובים לחלק התחתון של הבקבוקון המכיל את המשחה. לאחר השלמת ההעברה, הניחו מכסי כותנה היטב על שני הבקבוקונים והמתינו שלושה ימים. ביום השלישי, הכינו 100 תמיסת עבודה של ביוטין מיקרו-מולרי על ידי דילול מלאי ביוטין מולארי אחד במים מזוקקים משולשים. הוסף לתמיסה 500 מיקרוליטר של 0.5% חומצה פרופונית. מערבבים את תמיסת הביוטין עם אבקת שמרים יבשים ומערבבים לעיסה. הוסיפו כף מעבדה של רסק שמרי ביוטין לדופן של בקבוקון מזון ביוטין. חלקו את הזבובים לשתי קבוצות. העבירו קבוצה אחת לבקבוקון המכיל מזון רגיל כביקורת. העבירו את הקבוצה השנייה לבקבוקון מזון ביוטין בתוספת משחת שמרי ביוטין כדי להתחיל בהתרוממות רוח של ביוטין. לאחר 16 שעות, העבירו את הזבובים לבקבוקון חדש המכיל מזון רגיל. לאיסוף שחלות דרוזופילה, פיפטה מיליליטר אחד של מדיום חרקים קר של גרייס על צלחת הדיסקציה. בעזרת מלקחיים עדינים יש להניח זבוב נקבה לתוך צלחת החיתוך ולטבול אותה במדיום. החזיקו את בית החזה עם זוג מלקחיים אחד מבלי לרסק את הגוף. השתמש במלקחיים אחרים כדי להסיר בעדינות את קצה הבטן האחורית שבה נמצא איבר המין. סחטו לאט את השחלות החוצה באמצעות המלקחיים, החל מהבטן העליונה ונעו כלפי מטה. הסר רשתות שרירים ורקמות מסביב מבלי לפגוע בשחלות. העבירו שחלות נקיות לצינור של 1.7 מיליליטר באמצעות מלקחיים והשאירו את הצינור על קרח. לליזה של רקמות, הוסף 500 מיקרוליטר של 2% נתרן דודציל סולפט בניסיונות מלח חוצץ בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז לתוך הצינור המכיל את השחלות. המתן עד שהתאים יעברו ליזה והתמיסה תהפוך לדביקה. בצע סוניקציה באמצעות התנאים המוצגים על המסך. לאחר מכן, למשקעי אצטון, העבירו את הליזט לצינור כריכה נמוך של חמישה מיליליטר. הוסף אצטון קר לתוך הצינור פי שישה מנפח הדגימה. מערבל את הצינור לזמן קצר, ואז טען אותו לתוך רב מסובב ודגר למשך הלילה למשך כ-16 שעות במינוס 20 מעלות צלזיוס. גלולה את החלבונים המשקעים על ידי צנטריפוגה ב -15,000 גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. כעת, הוסף שני מיליליטר של תמיסת תערובת המורכבת מ-90% אצטון קר ו-10% ניסיונות מי מלח חוצצים. מערבבים את הגלולה והתמיסה על ידי פיפטינג בתנועה למעלה ולמטה. מערבל את הצינור לזמן קצר לפני שהעמיס אותו שוב לתוך המולטי-רוטטור ודגירה במשך שעתיים במינוס 20 מעלות צלזיוס. גלולה את החלבונים המשקעים על ידי צנטריפוגה ב -15,000 גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלכת הסופרנטנט, בצע סיבוב בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, פתח את הצינור ואפשר לגלולה להתייבש באוויר למשך 10 דקות. השעו מחדש את גלולת החלבון ב-500 מיקרוליטר של שמונה אוריאה טוחנת. העבירו את התמיסה לתוך צינור מילי-ליטר בגודל מיליליטר המכיל אקוסטיקה ממוקדת אדפטיבית או סיבי AFA. סוניקציה של השפופרת באמצעות אותם פרמטרים שהוצגו קודם לכן לפני ביצוע חומצה ביצינצ'ונינית, או BCASA, כדי לקבוע את ריכוז החלבון. דנטורציה של החלבונים באמצעות בלוק תרמו המוגדר ל-450 סל"ד למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס. הוסף חמישה מיקרוליטרים של דיתיותרייטול מולארי אחד מומס במים מזוקקים משולשים לצינור כדי להשיג ריכוז סופי של 10 מילימולר. הנח את הצינור שוב על בלוק התרמו למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס כדי להפחית את החלבונים. כעת הוסף 55 מיקרוליטר של תמיסת יודואצטמיד 400 מילי-מולרית לתוך צינור הדגימה כדי להגיע לריכוז סופי של 40 מילי-טוחנות לפני הכנסת הצינור בחזרה לבלוק התרמו לצורך אלקילציה. מדללים את הדגימה על ידי הוספת תמיסת אמוניום ביקרבונט של 50 מילי-מולרי עד שהנפח הכולל מגיע לארבעה מיליליטר. הוסף ארבעה מיקרוליטרים של תמיסת מלאי סידן כלוריד מולרית אחת לתוך הצינור כדי להגיע לריכוז סופי של מילימולר אחד. פיפטה למעלה ולמטה כדי להומוגני את התמיסה. לאחר מכן, הוסף 150 מיקרוליטר של מיליגרם אחד למיליליטר תמיסת מלאי טריפסין לשפופרת, תוך שמירה על יחס טריפסין לדגימה של אחד עד 20. עכל את החלבון באמצעות בלוק תרמו המוגדר ל -450 סל"ד למשך 16 שעות ב -37 מעלות צלזיוס. שטפו 150 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים מצומדים של סטרפטווידין לכל שלושה מיליגרם של דגימה עם מיליליטר אחד של שתי אוריאה טוחנת בניסיונות מי מלח. הכניסו מיליליטר אחד מהפפטידים המעוכלים לתוך השפופרת המכילה חרוזים וערבבו בעדינות. שלב את התערובת עם דגימת הפפטיד הנותרת בצינור קשירה נמוך של חמישה מיליליטר. לאחר דגירה של שעה, העבירו מיליליטר אחד מהתערובת לצינור של 1.5 מיליליטר והניחו אותו על מתלה מגנטי למשך דקה. שטפו את החרוזים פעמיים עם מיליליטר אחד של אוריאה טוחנת באמוניום ביקרבונט של 50 מילי-מולרית ופעם אחת עם מיליליטר אחד של מים מזוקקים משולשים לפני החזרת הצינור לרשת המגנטית למשך דקה נוספת והשלכת המאגר. לאחר מכן, פיפטה 100 מיקרוליטר של המאגר האלוציאני לתוך הצינור המכיל חרוזים, מערבבים בעדינות ומסירים פפטידים באמצעות בלוק תרמו המוגדר ל-300 סל"ד למשך חמש דקות ב-60 מעלות צלזיוס לפני הנחת הצינור שוב על המדף המגנטי. כעת העבירו את האלוט לצינור חדש של 1.5 מיליליטר, הימנעו מכל חרוזים. הדגימה המנופחת מוכנה כעת לייבוש ולשימוש לניתוח ספקטרומטריית מסה. איור זה מציג הדמיה קונפוקלית וניתוח אינטראקציה פרוטאומית של קישואים V5 TurboID לזיהוי חלבונים פרוקסימליים ואינטראקטיביים. תמונות קונפוקליות חשפו ביטוי חופף חזק בין טרנסגנים וחלבונים פרוקסימליים לאחר טיפול בהזנת ביוטין כפי שנלכד על ידי נוגדן V5 וסטרפטווידין מצומד Alexa Fluer 594 בהתאמה. ניתוח אונטולוגיה גנטית של פרוטאום הקישואים V5 TurboID חשף חלבונים מועשרים ביוטיניליים המעורבים בקיפול חלבון בתיווך מלווה, ארגון מערכת האנדומברנה וויסות ההובלה מהרטיקולום האנדופלזמי למנגנון GGI.