Per saperne di più sulla funzione di un gene, i ricercatori possono osservare cosa succede quando il gene viene inattivato o “eliminato”, creando animali geneticamente modificati. I topi Knockout sono stati particolarmente utili come modelli per malattie umane come il cancro, il morbo di Parkinson e il diabete.
I geni possono essere eliminati casualmente, o geni specifici possono essere presi di mira. Per eliminare un particolare gene, un pezzo di DNA ingegnerizzato chiamato vettore di puntamento viene utilizzato per sostituire il gene normale, inattivandolo in tal modo.
I vettori di “targeting” (puntamento) hanno sequenze su ogni estremità identiche, o omologhe, alle sequenze che fiancheggiano ogni lato del gene di interesse. Queste sequenze omologhe permettono al vettore di targeting di sostituire il gene attraverso la ricombinazione omologa, un processo che si verifica naturalmente tra il DNA con sequenze simili durante la meiosi.
Il vettore di targeting viene introdotto nelle cellule staminali embrionali del topo in coltura, utilizzando metodi come l’elettroporazione, usando impulsi elettrici per creare temporaneamente pori nella membrana cellulare. Tipicamente, per identificare le cellule in cui il vettore ha sostituito correttamente il gene, è progettato per includere un marcatore di selezione positiva, come il gene per la resistenza alla neomicina (NeoR),tra le regioni omologhe; e un marcatore di selezione negativo, come il gene della tiofina virale (TK), dopo una delle regioni omologhe.
Le cellule sono esposte alla neomicina, e solo quelle che hanno incorporato il vettore nel loro DNA sopravviveranno perché hanno il gene NeoR. Inoltre, le cellule, dove il vettore ha sostituito il gene bersaglio attraverso la ricombinazione omologa, non avranno il gene TK, permettendo loro di sopravvivere in presenza del farmaco ganciclovir. Pertanto, l’esposizione al ganciclovir viene utilizzata per eliminare le cellule che hanno il vettore inserito casualmente nel loro genoma, perché queste cellule avranno il gene TK.
Le cellule con il gene correttamente eliminato vengono quindi inserite in un embrione di topo, che viene impiantato nell’utero di una femmina, dove si sviluppa fino alla nascita. Il topo risultante è una chimera, che significa che è composto da una miscela di cellule, alcune con DNA normale dall’embrione, e alcune con il gene eliminato su un cromosoma dalle cellule ingegnerizzate. Questi topi sono allevati, e la prole contenente il gene nella loro linea germinale sono ulteriormente incrociati per creare una linea di topi in cui ogni cellula è omozicapra per il knockout. Questi topi knockout possono quindi essere utilizzati per studiare la funzione genica.
