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Tutte le attrezzature ei reagenti devono essere acquistati sterile o ha bisogno di essere calore o vapore, sterilizzati o sterilizzati con il 70% ETOH.
Gli autori affermano che gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le Comunità europee direttiva del Consiglio (86/609/CEE), seguendo le linee guida del NIH per quanto riguarda la cura e l'uso di animali nelle procedure sperimentali e le norme stabilite dalla Animal Istituzionale Cura e uso Comitato (IACUC) presso l'Università di Duisburg-Essen (Germania).
Parte 1: incubazione di uova
- Uova fecondate possono essere conservati a 13 ° C per un massimo di una settimana.
- Le uova vengono incubate per 72 ore, in posizione orizzontale in un incubatore con un vassoio in movimento, ruotando le uova 12 volte al giorno in continuo. L'umidità è mantenuto a 60 - 62%, temperatura di incubazione a 37,5 ° C.
Nota: Prima di iniziare l'incubazione, la sporcizia, piume ed escrementi sono accuratamente rimosso dai gusci d'uovo meccanicamente da un'asciugatura con comuni, asciugamani in carta grigia a zig-zag, che hanno una ruvida piuttosto che una struttura di superficie morbida. Pulendo le uova con etanolo o disinfettante, tuttavia, ha ridotto significativamente il tasso di sopravvivenza degli embrioni, indipendentemente dal liquido utilizzato.
Parte 2: Ex cultura ovo
- Dopo incubazione per 72 ore, le uova vengono rimossi dal termostato.
Nota: Le uova sono incubate per 72 ore perché - secondo i nostri esperimenti - per motivi sconosciuti, ma in accordo con Auerbach et fasi di sviluppo al.1 prima avevano tassi di sopravvivenza significativamente più bassi. Nelle fasi successive di 72 ore il sacco vitellino non ancora coperti dalla CAM diventa più sottile e tende ad aderire al guscio dell'uovo leader (i) a piccole emorragie nella zona di aderenza e (ii) la rottura del tuorlo, sacco membrana. Pertanto, il metodo presentato non è applicabile agli embrioni più di 72 ore. - La parte superiore delle uova, dove risiede l'embrione, è segnato dalla matita perché l'embrione resiste rotazione in una certa misura.
- L'uovo è tenuto in orizzontale con il segno a matita sulla parte superiore e screpolata ai margini di un bar 80 triangolare mescolare millimetri magnetica perpendicolare che orientato lungo l'asse dell'uovo.
Nota: per un feeling migliore, senza guanti devono essere utilizzati, ma le mani devono essere disinfettati con il 70% EtOH. E 'importante che il guscio d'uovo così come la membrana dell'uovo si aprono. Perdite di albume d'uovo è un segno sicuro che la membrana dell'uovo è stata perforata. - L'uovo è mantenuto vicino al fondo della scatola di Petri per evitare perdite maggiori di albume.
Nota: durante la procedura di apertura iniziale, è importante che il bianco d'uovo sul fondo della scatola di Petri è ancora collegato al resto dentro l'uovo come questo si traduce in un vuoto dentro l'uovo che contiene il tuorlo con l'embrione in alto all'interno l'uovo. Il vuoto può essere regolata sia per la pressione delle dita che controlla l'ingresso di aria nel uovo o sollevando l'uovo che aumenta la colonna collegati albume cioè il vuoto. - Delicatamente applicando una pressione al meridiano che passa attraverso la fessura e l'equatore l'uovo con il pollice e il medio, è possibile regolare il vuoto. Il contenuto dell'uovo possono poi essere trasferiti al Petri danneggiato, se l'uovo con il tuorlo viene delicatamente sollevato e le due metà della conchiglia sono accuratamente separati. L'embrione e il tuorlo vasi dovrebbe trovarsi in cima ad un tuorlo integro.
Nota: se il segno di matita non viene tenuto in alto, l'embrione potrebbe essere male quando rottura del guscio. Se le uova non sono incrinate con sufficiente attenzione o gli embrioni sono più vecchi di 72 ore (vedi sopra), il sacco vitellino si attacca al guscio e spesso rotture. Lo stesso accade quando l'umidità del incubatore è inferiore al 60% o le uova non vengono ruotate durante l'incubazione. - Ex ovo culture vengono restituiti in un incubatore e mantenuto a 37,5 ° 38,2 ° C e umidità 60%. CO 2 o O 2 alimentazione non è necessaria se l'incubatore non è chiuso ermeticamente (griglia di ventilazione parzialmente aperta!) E speciali piastre di Petri con distanziali tra coperchio e piatto vengono utilizzati.
Nota: Lo spostamento degli embrioni dovrebbe essere ridotto al minimo durante i primi giorni di incubazione. Risultati agitazione troppo elevati tassi di mortalità. Da incubazione giorno 9 in poi, gli embrioni sono meno sensibili alla agitazione.
Embrioni morti devono essere rimossi immediatamente per evitare infezioni.
Se incubatori per colture cellulari vengono utilizzati, che sono ermeticamente chiusi, O 2 l'offerta è obbligatoria per gli embrioni non morire. L'umidità è essenziale per la CAM non si secchi e se la temperatura di incubazione è inferiore a 37 ° C, gli embrioni si sviluppano troppo lentamente.
Parte 3: Applicazione di sostanze per saggi angiogenesi
- Autoclavato fogli piegati filtro (50,5 millimetri di diametro) vengono perforate da una perforatrice e utilizzato come materiale di supporto (carrier) per sostanze liquide applicate al CAM.
Nota: Quasi ogni materiale di supporto (vedi tabella sotto) ha causato l'irritazione del CAM, soprattutto se applicata prima del giorno di incubazione 10, come ha cambiato la sviluppo dell'architettura nave CAM. Ciò riguarda anche le sostanze potenzialmente inerti come la pellicola di cellulosa idrossietil, spugne Teflon (PTFE-tamponi), spugne di collagene, foglio di collagene, garze sterili (tamponi), copri-rotondo, e anelli di silicio, che ha causato tutti i risultati falsi positivi. Carta da filtro sembrava provocare il minor irritazione ed è stata quindi utilizzata nei nostri test. - Quando la CAM è pienamente sviluppato, fino a 6 diversi campioni possono essere applicati e dei loro effetti possono essere confrontati su un singolo CAM.
- Per evitare l'essiccamento dosi filtri aggiuntivi (3 mcg angiotropin nativo) o buffer (5 microlitri PBS) deve essere nuovamente applicata ogni giorno.
- Dal 3 ° giorno dopo l'applicazione, i vasi sanguigni orientare verso le sostanze angiogenico sui filtri, mentre il modello dei vasi sanguigni circostanti controlli è invariato.
Nota: La CAM non deve essere confuso con il tuorlo-sacco. Il CAM è una struttura dinamica di sviluppo, mentre il sacco vitellino è statico, con variazioni poco durante lo sviluppo. Il giorno di sviluppare tre il CAM di sviluppo possono essere riconosciuti per la prima volta alla fine caudale dell'embrione come una piccola vescicola. Tra tre giorni e dieci giorni di vescicola iniziale si espande, creando una piegato due strati di membrana overgrowing il sacco vitellino ad un tasso crescente. Il sito di applicazione dovrebbe essere a metà strada tra embrione e la piega del CAM (confine) altrimenti l'embrione ostacola l'osservazione microscopica di effetti in luce trasmessa. In alternativa, il filtro con la sostanza angiogenico è interiorizzato quando la CAM continua a crescere.
Parte 4: inoculazione di cellule sul CAM
4.1.Preparation di cellule
- Cellule confluenti vengono trasferiti dal fiasco cultura ai tubi FALCON con l'uso di una pipetta sterile 25 ml in plastica con una pipetta di aiuto.
- Per stimare il numero di cellulare, 15 ml di sospensione cellulare viene trasferito in una camera di Neubauer e le cellule vengono conteggiati manualmente al microscopio.
- Falcon tubi vengono centrifugati per 3 min a 1000 rpm a temperatura ambiente e il supernatante viene scartato.
- Per il monitoraggio delle cellule vive, le cellule sono diluiti con PBS alla concentrazione desiderata (qui: 2x10 7 cellule / ml) e colorati con ad esempio PKH26 (Sigma), un rosso fluorescente vivere membrana cellulare kit etichettatura, secondo i produttori 'protocollo.
Le cellule sono risospese in terreno di coltura cellulare (preferibilmente medio Dulbecco modificato aquila; DMEM) alla concentrazione desiderata per l'iniezione (10 7 cellule / ml) o inoculazione (3x10 6 cellule / ml). Le concentrazioni di cellule differenti sono applicati per le iniezioni contro l'inoculazione in base alle concentrazioni già pubblicati in letteratura 15-17 e la nostra esperienza.
4,2 inoculazione di cellule sul CAM
- Anelli (~ spessore 1mm) sono tagliati da un puntale da 1 ml o un catetere venoso periferico (PVL) Tubo con l'uso di un bisturi tagliente e applicato al CAM di un E6-E14 pulcino ex ovo embrione in coltura.
Nota: Cerca di non "visto" più volte, ma per tagliare la punta della pipetta o catetere con un taglio con un bisturi nuovo, molto forte per evitare spigoli vivi sugli anelli risultante. Controllare gli anelli sotto il microscopio di spigoli vivi che derivi dalla micro-fessure. - A seconda delle dimensioni degli anelli 20 l di 3x10 6 cellule / ml cellule sono pipettati in totale in un anello o come volumi divisi in anelli multipli.
Nota: In alcuni casi traumatizzazione del CAM raschiando dolce è un pre-requisito, ad esempio, per facilitare l'inoculazione di cellule 17 e capillarizzazione degli innesti (vedi sotto). Se, invece, traumi della CAM non è destinato o contraindicative, ad esempio per lo studio del potenziale invasivo delle cellule tumorali, gli anelli non devono essere utilizzati per l'inoculazione, ma le cellule devono essere applicati direttamente come applicazione di anelli o anelli stessi potrebbe indurre lesioni micro . Se gli anelli sono utilizzati, questi devono essere tagliate il più sottile possibile per minimizzare il peso ed evitare il rientro del CAM.
Parte 5: iniezione intravitreale di cellule
- Una siringa Hamilton microlitri è risciacquato più volte con EtOH 70% e infine con PBS sterile.
- La siringa micro è riempito con la sospensione preparata cellula colorata o senza macchia (cfr. parte 4.1).
Nota: il sito di iniezione deve essere scelto con cura, per non danneggiare i vasi sanguigni delle strutture CAM o adiacente dell'embrione (brain!) da più di penetrazione con l'ago. L'iniezione deve essere fatta sotto un binocolo dissezione. - Sotto il controllo microscopio, Con attenzione, ma rapidamente penetrare il CAM e strati occhio con l'ago della siringa e iniettare continuamente da 10 a massimo 20 microlitri sospensione cellulare (preferibilmente diluito in PBS) nel vitreo dei ovo embrione ex pulcino colta.
Nota: se la CAM non può essere penetrato con l'ago, potrebbe essere rimossa in un sito con i vasi sanguigni poche o nessuna con delicatezza lacerando con due pinze. - L'ago deve rimanere 1-2 secondi in un occhio per evitare una perdita di sospensione cellulare iniettato da perdite.
Parte 6: dissezione di gemme degli arti pollo
- Le uova sono ritirate dall 'incubatrice dopo 3 o 4 giorni di incubazione (E3/E4 = Hamburger Hamilton (HH) stage18-23)
- Le uova sono rotto sul bordo di una barra triangolare ancoretta magnetica e trasferiti in una piastra di Petri (dettagli: si veda Parte 2) e l'embrione viene sezionato dai vasi tuorlo collegati da taglio un cerchio con le forbici a molla.
- L'embrione viene trasferito in un piatto fresco Petri riempite con il freddo, sterile PBS con l'uso di un cucchiaio di scarico piccola e bagnata dal agitazione genere.
- L'embrione viene trasferito in una piccola scatola di Petri riempite con PBS sterile e liberati dalle membrane circostanti, accuratamente lacerando con una pinza sottile.
- Gemme degli arti si staccano da pinze microchirurgica più vicino al corpo il più possibile, colto e trasferito al CAM di un 8-10-giorno-vecchio ospitare ex ovo di pollo in coltura (vedi procedura di trapianto).
Parte 7: Preparazione di gemme degli arti del mouse
- Accoppiamenti tempo in stato di gravidanza sono istituiti e la mattina del giorno in cui viene rilevato un plug vaginale in accoppiamento le femmine è designato 0 gestazione giorno.
- La femmina gravida, è stato immolato per dislocazione cervicale quando lo sviluppo degli embrioni raggiunto giorni embrionale (E) 10 a 13 e fissato su un bordo di cera.
- La parete addominale è inumidito con il 70% ETOH, tagliare lungo la linea mediana e la lembi cutanei vengono fissati lateralmente da perni.
- Entrambe le corna dell'utero vengono rimossi con l'addome, distaccato e trasferito in un bicchiere con PBS freddo.
- Gli embrioni sono separati, trasferito in una piastra di Petri e la parete dell'utero e delle membrane embrionali vengono rimossi con attenzione con l'uso di forcipe.
- Gemme degli arti vengono tagliati con l'uso di forbici primavera o distaccato da una pinza sottile più vicino al corpo il più possibile, colto e trasferito al CAM di 8-10-giorno-vecchio ospitare ex ovo di pollo in coltura (vedi procedura di trapianto).
Parte 8: Raccolta dei campioni di tumore
- Biopsie del tumore sono raccolti in provette Eppendorf da 2 ml riempito con cellule tumorali specifici per mezzo di coltura (qui: media Leibovitz) e conservato a temperatura ambiente.
- Biopsie del tumore sono tagliati in pezzi da 1-2 mm3 bisturi sterile.
Nota: Se i campioni tumorali erano troppo piccoli, potrebbero non allegare alla CAM, se fossero troppo grandi, la CAM potrebbe essere ferito e l'embrione potrebbe morire. - Un pezzo dal nucleo del campione bioptico si innesta il CAM di 8-10-giorno-vecchio ospitare ex ovo di pollo in coltura (vedi procedura di trapianto).
Nota: Prendendo materiale dalla superficie della biopsia aumenta il rischio di contaminazione con il muscolo o del tessuto connettivo.
Parte 9: procedura di trapianto
- Per l'innesto di gemme arto o campioni di tumore, il pieno sviluppo della CAM 8-10-giorno-vecchi embrioni di pollo in coltura ex ovo viene utilizzato.
- Gli innesti sono nella posizione ideale sulla CAM Y vicino ad una biforcazione di un vaso sanguigno.
- Presso il sito di applicazione desiderata, la CAM è selettivamente traumatizzato da fuori raschiatura dolce (forcipe) la parte superiore peridermal del doppio strato epiteliale, lasciando intatto lo strato basale.
Nota: è essenziale per evitare sanguinamenti o rottura di capillari visibili. - L'innesto è trasferito al CAM con il minimo PBS allegato. A seconda del trapianto, potrebbe essere inserito una o due volte su un sito del CAM, dove non è previsto alcun innesto finale di rimuovere eccessive PBS e poi finalmente innestato nel sito preparato CAM traumatizzati.
- L'innesto viene afferrata da una pinza sottile e stratificato sul CAM. A seconda della sensibilità del trapianto, una leggera pressione potrebbe essere applicata (non adatto per gemme degli arti) per manovrare l'innesto in una rientranza risultante del CAM (adatto per campioni di tumore).
Nota: Poiché il sistema immunitario sviluppa pulcino al giorno embrionale (E) 18, ex ovo xenotrapianti culture non deve essere prolungato al di là E17 come gli embrioni ospitare pulcino spesso muoiono.
E 'importante avere a disposizione CAM ospitare, rispettivamente ex ovo embrioni di pollo in coltura, in coincidenza con una fonte di tessuti del donatore di vostra scelta.
Parte 10: Re-trapianto
- L'embrione di pollo host viene ucciso per decapitazione.
- Il CAM conl'innesto allegato viene rimosso mediante un taglio circolare con le forbici a punta e trasferito in una piastra di Petri riempita con PBS.
- CAM eccessivo è tagliato dal trapianto di forbici a molla, tranne per il sito ex allegato.
- In caso di campioni tumorali più grande, l'innesto viene tagliato a metà o più pezzi più piccoli e ri-innestati con il tagliente rivolto verso il CAM nuovo del secondo host.
Parte 11: Risultati Rappresentante
Figura 1. Shell-meno pollo cultura
Embrioni di pollo di diverse fasi di sviluppo ex ovo colto in piastre di Petri.
Figura 2. Ex ovo saggio dell'angiogenesi CAM
Uova di gallina fecondate sono state incubate in orizzontale a 37 ° C e umidità del 60 - 62% e screpolata in piastre di Petri al giorno embrionale 4 (E4). L'incubazione è proseguita nelle stesse condizioni. A E10 carte filtro sterile (5,5 mm di diametro) sono state stratificate sulla parte superiore del CAM e imbevuto sia con 5 microlitri PBS o 3 mg nativo angiotropin6. Capillari ha mostrato evidenti allineamento verso la carta imbevuta angiotropin filtro E14.
Figura 3. Ovo Ex innesti di gemme degli arti
Gemme degli arti da pulcino (E3/E4) e mouse (E13) sono stati innestati i CAM del guscio inferiore culture pollo. I vasi sanguigni dal CAM inseriti i germogli arto dopo due giorni. Lo sviluppo delle gemme degli arti continuato in queste culture ex ovo raggiungendo una falange in due fasi pulcino e la visualizzazione di riduzione delle reti interdigitali in gemme degli arti murini.
Figura 4. Ex ovo inoculazione del campione di tumore
Un campione bioptico di carcinoma della vescica è stato inoculato sul CAM di un 10-pulcino ex ovo embrione in coltura. Dopo due giorni di cultura, il campione del tumore è stato collegato al sistema vascolare CAM e dopo 7 giorni, i vasi sanguigni più entrare nel trapianto sono stati osservati.