Iniezione intratoracica: somministrazione di composti al cuore adulto di pesce zebra

1. Preparazione del pesce per l'iniezione intratoracica

1. Cattura un pesce zebra adulto (Danio rerio) con una rete e trasferiscilo nella soluzione anestetica.
2. Dopo 1−2 minuti, quando il pesce smette di nuotare e il movimento dell'opercolo è ridotto, toccare il pesce con un cucchiaio di plastica per assicurarsi che non reagisca ad alcun contatto.
3. Trasferisci rapidamente e con cura il pesce con il cucchiaio nella scanalatura della spugna bagnata, con il lato ventrale rivolto verso l'alto. La testa del pesce deve essere rivolta lontano dalla mano dominante dell'operatore.

2. Microiniezione nel Pericardio

1. Sotto lo stereomicroscopio, osservare attentamente il movimento del cuore che batte sotto la pelle del pesce. Determinare visivamente il punto di iniezione sopra il cuore pulsante e al centro del triangolo definito dalle placche cartilaginee ventrali (Figura 1D). Inserire la punta del capillare con un angolo di 30-45° rispetto all'asse del corpo (Figura 1E). Penetrare delicatamente la pelle con la punta del microcapillare nel pericardio (Figura 1C). Un punto di ingresso ottimale è più vicino all'addome che alla testa.
   nota: Non inserire il capillare troppo in profondità nel corpo e nel cuore, poiché ciò causerebbe lesioni all'organo. In caso di puntura cardiaca, l'ago generalmente si riempie di sangue. Se ciò accade, rimuovere il capillare ed escludere il pesce dall'esperimento.
2. Una volta che l'ago è all'interno del pericardio, completare l'iniezione premendo il pedale del dispositivo microiniettore.
   nota: Fare attenzione a non iniettare aria nella cavità toracica.
3. Dopo l'iniezione, prelevare delicatamente il capillare dal torace e trasferire immediatamente il pesce in una vasca con acqua di sistema per il recupero.
4. Monitorare i pesci fino al completo recupero dall'anestesia.
5. Raccogli il cuore nel momento desiderato e preparalo per ulteriori analisi.
   nota: Nel caso in cui il pesce non riprenda il movimento dell'opercolo entro 30 s, rianimare il pesce spremendo l'acqua nelle branchie con una pipetta di plastica.

Figura 1: Iniezione intratoracica (IT) in zebrafish adulto. (A) Fotografia di un capillare di microiniezione tirato con filamento (6", 1,0 mm di diametro) e valori del programma di estrazione dell'ago utilizzato. (B) Fotografia di un capillare di microiniezione tirato con filamento (6", 1,0 mm di diametro) riempito con 2,5 μL di soluzione contenente il 10% di rosso fenolo. La punta tirata dell'ago è lunga al massimo 7 mm. (C) Rappresentazione schematica della procedura di iniezione IT. (D) Fotografie della procedura di iniezione IT. Questa cifra è stata modificata da Bise et al. I numeri nei pannelli C e D corrispondono alle stesse fasi della procedura: (1) il pesce viene posto con il lato ventrale rivolto verso l'alto su una spugna umidificata. Il sito di puntura (punto rosso nel triangolo) si trova al centro del torace vicino alle branchie. (2) Penetrazione dell'ago nel pericardio. Il punto rosso indica il sito di puntura. (3) L'iniezione viene monitorata osservando la diffusione della soluzione rossa nella cavità pericardica. (E) Schema di iniezione informatica. L'angolo tra il capillare di iniezione e l'asse del corpo deve essere compreso tra 30° e 45° per evitare la puntura cardiaca. (F) Fotografie del torace di pesce a 1 ora dall'iniezione IT dei volumi indicati. Le frecce bianche puntano verso il tessuto rossastro, il che potrebbe indicare un'emorragia interna