Trattamento con streptozocina: un modello di pesce zebra di diabete mellito di tipo 1

1. Generazione di Zebrafish con Diabete mellito, DM Fish

1. Preparare sia i serbatoi dell'acqua di recupero che quelli dell'anestesia. L'acqua di recupero è una normale acqua per pesci. Per l'acqua anestetica aggiungere una quantità sufficiente di 2-fenossietanolo in modo da ottenere una diluizione 1:1.000 in acqua di pesce normale.
2. Preparare una soluzione allo 0,3% (in una cappa aspirante) di streptozocina (STZ) aggiungendo 6 mg di STZ a 2 ml di cloruro di sodio allo 0,09% e porre immediatamente la soluzione sul ghiaccio. In questo modo si otterrà una soluzione iniettabile sufficiente per l'iniezione di circa 20 pesci in 20 minuti. Se superi i 20 minuti, fermati e prepara una nuova soluzione STZ prima di procedere. In una provetta separata, aliquote una quantità sufficiente di soluzione salina per i pesci di controllo. Una volta solubilizzato l'STZ, tutti i passaggi successivi non richiedono l'uso di cappe.
3. Riempire una siringa da 1/2 cc dotata di un ago da 27 1/2 gauge con l'STZ o soluzioni di controllo assicurandosi che non rimangano intrappolate bolle d'aria.
4. Anestetizzare ogni pesce individualmente mettendolo in acqua anestetica e attendere che il loro movimento di nuoto cessi (1-2 minuti).
5. Una volta anestetizzato posizionare brevemente il pesce su un tovagliolo di carta per assorbire l'acqua in eccesso, posizionare il pesce nella pesa e misurare la massa del pesce.
6. Posizionare il pesce su una superficie solida (coperchio della capsula di Petri) per l'iniezione iniettabile.
7. Iniettare l'STZ o la soluzione di controllo nella cavità peritoneale del pesce inserendo l'ago oltre lo smusso nella faccia posteriore del peritoneo ventrale.
8. A ciascun pesce devono essere somministrati 0,35 mg/g (350 mg/kg) di STZ e il volume della soluzione allo 0,3% necessaria può essere calcolato nel modo seguente.
   1. Moltiplicare la massa di pesce (g) per 0,35 per ottenere la quantità di STZ in mg richiesta.
   2. Dividere il prodotto generato sopra per 3 per ottenere il volume della soluzione allo 0,3% necessaria per l'iniezione in μl.
      Campione: Per un pesce di 0,5 g : a) 0,5 x 0,35 = 0,175 b) 0,0175/3= 0,058 ml = 58 μl.
      Lo stesso volume senza l'STZ verrebbe iniettato per un pesce di controllo. Un foglio per i volumi da iniettare per massa di pesce dovrebbe essere generato e utilizzato per una rapida consultazione.
9. Dopo l'iniezione, posizionare i pesci nella vasca dell'acqua di recupero e monitorarli per la normale attività di nuoto. Una volta raggiunto questo obiettivo, i pesci vengono trasferiti in una normale vasca vivente che viene mantenuta a una temperatura ridotta di 22 °C - 24 °C. Questa temperatura ridotta è fondamentale per un'efficace induzione dell'iperglicemia (diabete mellito, DM).
10. Sebbene l'iperglicemia venga rilevata entro 24 ore dalla prima iniezione, per indurre uno stato prolungato di iperglicemia molto elevata il pesce zebra richiede una frequente fase di induzione dell'iniezione seguita da iniezioni settimanali di mantenimento come mostrato di seguito.

Settimana 1: 3 iniezioni (Giorno 1, 3, 5), Settimana 2: 1 iniezione (Giorno 12), Settimana 3: 1 iniezione (Giorno 19), Settimana 4: (Giorno 21) Eseguire il test di interesse.

A questo punto si ritiene che il pesce zebra sia stato in uno stato prolungato di iperglicemia e mostri le complicanze diabetiche della retinopatia, della nefropatia e anche della ridotta rigenerazione delle pinne. Questi sono indicati come pesci DM. Inoltre, se lo si desidera, il pesce può essere mantenuto nello stato iperglicemico con iniezioni di mantenimento settimanali. Ci si dovrebbe aspettare circa il 5% di morte durante questo processo.