Impianto ecoguidato: una tecnica per impiantare cellule di adenocarcinoma duttale pancreatico in un topo adulto

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di jove.

1. Preparazione Pre-Chirurgica dei Topi

NOTA: Si consiglia di eseguire questo passaggio 24 ore prima della procedura.

1. Posizionare le gabbie contenenti topi sperimentali su una temperatura più calda a 37°C.
2. Procurarsi gabbie nuove e pulite e posizionarle su una seconda piattaforma riscaldante impostata a 37°C.
3. Pulire accuratamente la cabina di sicurezza biologica, la camera di induzione e il tavolino a ultrasuoni (US) con sterilizzante (vedi Tabella dei materiali).
4. Ruotare la funzione di riscaldamento del tavolino USA a 37°C.
5. Accendere l'anestesia: regolare le manopole sul divisore del tubo in modo che il flusso d'aria sia limitato alla sola camera di induzione. Accendere la bombola di ossigeno e impostare la portata su 1 L/min. Accendi il vaporizzatore di isoflurano al 2-3%.
6. Posizionare un singolo mouse nella camera di induzione. Monitorare il mouse fino a quando non si smette più di muoversi e la respirazione è rallentata.
7. Regolare le manopole sullo splitter in modo che il flusso d'aria sia consentito sia alla camera di induzione che al cono anteriore. Spostare rapidamente il topo dalla camera di induzione e adagiarlo in decubito ventrale sul caldo palco degli Stati Uniti con il muso nel cono del naso.
8. Testare il livello di induzione osservando qualsiasi risposta riflessiva al pizzicamento delle dita dei piedi. Se non ce n'è, il mouse è pronto per la depilazione.
9. Applicare una piccola quantità di lubrificante per gli occhi (vedere la Tabella dei materiali) su entrambi gli occhi per prevenire la disidratazione dei tessuti. Girare il mouse in modo che si trovi in decubito dorsale sul palco. Far aderire delicatamente gli arti superiori e inferiori al tavolino con del nastro di carta per massimizzare l'esposizione dell'addome e fissare il mouse al tavolino.
10. Utilizzare un applicatore sterile con punta di cotone per applicare uno strato generoso di crema depilatoria sul quadrante superiore sinistro dell'addome. Il depilatorio deve essere applicato nella zona generale della milza ed estendersi verso la linea mediana. Lasciare riposare per circa un minuto.
11. Testare il grado di depilazione utilizzando delicatamente l'estremità opposta dell'applicatore con punta di cotone per rimuovere la crema depilatoria, una volta rimossa facilmente, pulire l'addome con una garza asciutta. Quindi bagnare uno strato pulito di garza con una piccola quantità di soluzione salina calda e pulire nuovamente l'area per rimuovere completamente l'agente depilatorio. Non superare i 2 minuti interi di contatto diretto sulla pelle del topo per ridurre la possibilità di ustioni chimiche.
12. Una volta che i peli sono stati sufficientemente rimossi dall'addome, rimetti il topo in una nuova gabbia pulita su uno scaldino.
13. Mentre il primo animale è sottoposto a depilazione sul palco statunitense, l'animale successivo può essere aggiunto alla camera di induzione.
14. Prima di anestetizzare la prossima gabbia di topi, spegnere l'isoflurano e lavare la camera di induzione con ossigeno. Pulire la camera di induzione e lo stadio USA/cono anteriore con sterilizzante. Ripetere i passaggi 1.5-1.14 fino a quando tutte le gabbie e i topi non sono stati sottoposti a depilazione.
    nota: Si può considerare che gli animali a digiuno mediante sospensione temporanea del cibo per un periodo prima dell'impianto riducano al minimo l'ostruzione visiva degli organi addominali dovuta al cibo non digerito nello stomaco e nell'intestino (12-24 ore). Si sconsiglia la restrizione dell'acqua. Se gli animali sono a digiuno, si raccomanda di trattarli con un'iniezione di 1 ml di soluzione salina calda (37°C) sterile dopo l'iniezione del tumore per prevenire la disidratazione.

2. Impianto ecoguidato di cellule PDA

NOTA: Tutte le procedure ecografiche vengono eseguite utilizzando macchine e software per l'imaging a ultrasuoni (vedi Tabella dei materiali). Il trasduttore ha una frequenza centrale di 40 MHz e una larghezza di banda di 22-55 MHz.

1. Regolare la piattaforma ecografica in modo che la superficie della piattaforma sia parallela al pavimento e l'investigatore sia rivolto verso il lato sinistro dell'animale, con la testa dell'animale a destra. Regolare la posizione del trasduttore in modo da ottenere un'immagine addominale trasversale (Figura 1A).
2. Anestetizzare il topo da iniettare come descritto nei passaggi 1.1-1.8. Stabilizzare il mouse sulla piattaforma statunitense come descritto nel passaggio 1.9.
3. Applicare una generosa quantità di gel per ultrasuoni caldo (37°C) sulla sezione glabra dell'addome.
4. Abbassare delicatamente il trasduttore per entrare in contatto con l'addome del topo. Regolare il trasduttore secondo necessità fino a quando il pancreas non è chiaramente visibile. Localizzare il rene sinistro e la milza per fornire un orientamento accurato della cavità addominale.
   nota: Poiché la posizione del trasduttore è stata modificata per consentire l'accesso al lato sinistro dell'addome, gli assi X e Y sui controlli del tavolino sono ora invertiti.
5. Caricare una siringa da insulina da 29 G x 1/2" (vedere la tabella dei materiali) con 25 μl di sospensione di cellule tumorali. Pulire la punta dell'ago con un tampone sterile per la preparazione dell'alcol prima dell'iniezione per ridurre al minimo l'inseminazione delle cellule tumorali nella parete addominale.
6. Usando una pinza smussata, afferrare la pelle e la parete peritoneale per aumentare la tensione nel sito di iniezione desiderato. Tenendo la siringa a un angolo di circa 25°-45° rispetto alla superficie della piattaforma ecografica, far avanzare lentamente l'ago attraverso la pelle e la parete peritoneale. Verificare che l'ago abbia perforato la parete peritoneale prima di procedere al passaggio successivo. Si dovrebbe avvertire un piccolo schiocco quando l'ago perfora la parete peritoneale.
7. Nella visualizzazione ecografica, guidare l'ago direttamente nel pancreas (Figura 1B-C). Verificare che l'ago sia all'interno del tessuto del pancreas muovendo delicatamente il cilindro della siringa su e giù. Se il posizionamento è corretto, la punta dell'ago rimarrà all'interno del tessuto pancreatico mentre il cilindro della siringa è in movimento.
8. Iniettare lentamente le cellule tumorali e confermare che le cellule vengono impiantate nella posizione desiderata mediante la formazione di un bolo di liquido all'interno del pancreas (visibile sullo schermo dell'ecografia, Figura 1D).
   nota: Si avverte una certa resistenza mentre si preme lo stantuffo. Fare attenzione a non perforare il pancreas più volte in quanto ciò aumenta la probabilità di perdite nella cavità addominale.
9. Una volta che l'intero volume della sospensione è stato iniettato e un bolo di liquido può essere visto nel pancreas, tenere l'ago molto fermo per alcuni secondi. Ritrarre lentamente l'ago dall'addome del topo, facendo molta attenzione a non disturbare le cellule iniettate.
10. Metti il mouse in una gabbia pulita e calda e assicurati che il topo si riprenda completamente dall'anestesia. Ripeti questo processo per tutti gli animali.
11. Prima di anestetizzare il topo successivo, pulire la camera di induzione e il tavolino/cono del naso con sterilizzante.
12. Ripetere i passaggi 2.2-2.11 fino a quando tutti i topi sono stati iniettati.

Figura 1: Impianto ecoguidato di cellule PDA nel pancreas murino. (A) Orientamento del mouse, del tavolino ecografico e della sonda ecografica utilizzati per ottenere un'immagine ad alta risoluzione degli organi addominali. Si noti che il tavolino e la piattaforma sono stati ruotati di 90° rispetto all'orientamento standard per consentire un facile accesso al quadrante superiore sinistro dell'addome del topo. (B) Immagine ecografica che raffigura l'identificazione di rene, milza e pancreas. Qui l'ago per iniezione è posizionato contro l'addome del topo. (C) Immagine ecografica raffigurante l'ago all'interno del pancreas del topo. (D) Immagine ecografica che raffigura la bolla nel sito di iniezione (delineata in blu) dopo l'iniezione controllata di cellule tumorali nel pancreas. (E) Laparotomia che rivela il bolo fluido contenente le cellule PDA nel pancreas dopo l'iniezione ecoguidata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.