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Abstract

Fonte: Jia, Z. et al., Un test Dot Blot da 5 mC che quantifica il livello di metilazione del DNA della dedifferenziazione dei condrociti in vitro.J. Vis. Exp.(2017)

Questo video descrive la tecnica del dot-blot per determinare il livello di metilazione del DNA nei condrociti umani in vitro tramite il blotting di campioni di DNA su una membrana di nylon e la successiva visualizzazione utilizzando anticorpi monoclonali. Questo aiuta a determinare il fenotipo dei condrociti nelle varie fasi della coltura.

Protocol

1. Raccolta di tessuto della cartilagine articolare umana e coltura dei condrociti

1. Preparazione dei materiali
   1. Preparare il terreno eagle medium modificato (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di siero fetale bovino e l’1% di penicillina-streptomicina. Preparare 1 mg/mL di collagenasi II, tripsina-EDTA allo 0,25%, soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e un colino cellulare (nylon da 40 μm).
2. Raccolta di tessuto cartilagineo articolare umano
   1. Isolare la cartilagine articolare dalle articolazioni del ginocchio dei pazienti donatori dopo un trauma. Ottenere il consenso informato da tutti i partecipanti.
   2. Tagliare la cartilagine in³ pezzi di 1-2 mm utilizzando un bisturi sterile e digerire i condrociti dalla cartilagine tritata con 1 mg/mL di collagenasi II in DMEM a 37 °C per 12-16 ore.
   3. Filtrare la sospensione cellulare risultante attraverso un filtro cellulare (40 μm) e lavare due volte con PBS.
   4. Contare le cellule con un emocitometro e seminare a una densità di 20.000-30.000 cellule/^cm2 in DMEM integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l’1% di penicillina-streptomicina.
   5. Coltura in incubatore a 37 °C.
3. Espansione dei condrociti monostrato
   1. Raccogliere le cellule sub-confluenti utilizzando tripsina-EDTA allo 0,25% e ri-placcare a una densità di 6.600 cellule/cm². Cambia il mezzo due volte a settimana.
   2. Coltura di condrociti in monostrati per un massimo di sei passaggi e valutazione nei passaggi 1, 2, 3, 4 e 5.

2. Estrazione del DNA genomico (gDNA)

1. Raccogliere le cellule e risospenderle in un tampone di lisi da 500 μL (15 mM Tris pH 8.0, 10 mM EDTA pH 8.0, 0,5% SDS, 200 μg/mL RNasi A) per 10 milioni di cellule. Risospendere le cellule mediante pipettaggio e inversione rapida, quindi incubare per 1 ora a 37 °C.
2. Aggiungere la proteinasi K a una concentrazione di 160 μg/mL di lisato cellulare e capovolgere energicamente la miscela. Incubare 6 ore a 55 °C.
3. Aggiungere al campione un volume di Tris pH 7.9 fenolo:cloroformio:alcol isoamilico saturo (25:24:1). Agitare accuratamente il campione a mano per circa 20 s.
4. Centrifugare il campione a temperatura ambiente per 5 minuti a 13.000 × g. Rimuovere la fase acquosa superiore e trasferire lo strato in una provetta nuova.
5. Estrarre con un volume uguale di cloroformio per rimuovere il fenolo e trasferire la fase acquosa superiore in una provetta nuova.
6. Precipitare il DNA aggiungendo 0,1 volumi di campione di acetato di sodio 3 M pH 8,0 e 2 volumi di etanolo al 100%.
7. Conservare la provetta a -20 °C durante la notte per far precipitare il gDNA.
8. Centrifugare il campione a 4 °C per 10 minuti a 16.000 x g in pellet di gDNA.
9. Lavare il campione tre volte con etanolo al 70% e centrifugare a 4 °C per 2 minuti a 13.000 x g.
10. Rimuovere con cura il surnatante e poi asciugare all’aria. Risospendere il DNA in 10 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM EDTA.

3. Profilo di metilazione del DNA

1. Utilizzare un kit di metilazione del DNA per eseguire la reazione di conversione del bisolfito utilizzando un totale di 500 ng di DNA genomico, secondo il protocollo del produttore. Eluire in 10 μL di tampone di eluizione (50 ng/μL).
2. Eseguire il profilo di metilazione del DNA utilizzando un kit commerciale secondo il protocollo del produttore.

4. Analisi del Dot Blot

1. Denaturare il DNA isolato (1 mg per campione) in NaOH 0,1 M per 10 minuti a 95 °C. Neutralizzare il DNA con 1 M di NH₄OAc su ghiaccio, quindi diluire due volte. Spot 2 μL del DNA genomico diluito seriale su una membrana N⁺.
2. Tamponare la membrana a 80 °C per 30 minuti.
3. Bloccare i siti di legame degli anticorpi non specifici immergendo la membrana N⁺ in BSA al 5% in TBS-T per 1 ora. Utilizzare una piastra di Petri da 10 cm come camera di reazione a temperatura ambiente.
4. Dopo aver lavato 5 minuti tre volte in TBST, incubare la membrana con un anticorpo monoclonale di topo anti-5-metilcitosina (5-mC) (1:1.000) in TBS-T a 4 °C per una notte.
5. Lavare la membrana per 5 minuti tre volte in TBS-T, quindi incubare con un anticorpo secondario, immunoglobulina di pecora (IgG) di pecora (1:5.000) coniugata con HRP (1:5.000) in TBS-T per 1 ora a temperatura ambiente.
6. Lavare la membrana per 5 minuti tre volte in TBS-T.
7. Aggiungere il substrato enzimatico alla membrana e incubare per 5-10 minuti. Visualizzare il segnale dell’anticorpo secondario utilizzando un kit di chemiluminescenza secondo le istruzioni del produttore.

Materials

<strong>Reagents</strong>
DMEM&nbsp;&nbsp;	Gibco Inc.	11965&ndash;092	Warm in 37 &deg;C water bath before use
Phosphate-Buffered Saline(PBS)	HyClone Inc.	SH30256.01B	D-PBS, free of&nbsp;Ca2+/Mg2+
FBS	Gibco Inc.	10099-141
0.25%Trypsin/EDTA	Gibco Inc.	25200-056
1%Penicillin-Streptomycin	Gibco Inc.	15140-122
Chloroform	Mallinckrodt	4440
Isoamyl Alcohol	Sigma	I-3643
Phenol	Gibco BRL	15513-039
Proteinase K	Gibco BRL	24568-2
TAE buffer&nbsp;	Bio Whittaker	16-011V
Distilled Water	Gibco BRL	15230-170
1 M Tris-HCl	Biosharp Inc.	BL514A
Tween20	Biotopped Inc.	C58H114O26
BSA	Proliant Inc.	68700
Collagenase, Type II	Sigma-Aldrich	C6885
<strong>Equipment</strong>
Cell Strainer (40&mu;m nylon)	FALCON Inc.	352340
Hemocytometer	ISOLAB Inc.	075.03.001
Falcon 100 mm&nbsp; dish	Corning	353003
Centrifuge Tubes	TPP AG	91050	Gamma-sterilized
High-speed centrifuge	Eppendorf	5804R
ThermoMixer	MIULAB	MTH-100
Carbon dioxide cell incubator	Thermo scientific	3111
Chemi-imaging Analyse System	UVITEC Cambridge	ALLIANCE