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Abstract

Fonte: Hillert-Richter, L. K. et al., Misurazione della composizione del complesso di segnalazione CD95 che induce la morte e l’elaborazione della procaspasi-8 in questo complesso. J. Vis. Exp. (2021).

Questo video descrive il western blotting basato sulla chemiluminescenza di lisati immunoprecipitati. La tecnica aiuta a determinare l’elaborazione e l’attivazione delle proteine. Il segnale chemiluminescente rilevato è proporzionale al livello di elaborazione delle proteine durante la sua attivazione.

Protocol

Gli esperimenti sulle cellule T sono stati eseguiti secondo l’accordo etico 42502-2-1273 Uni MD.

1. Preparare le cellule per l’esperimento

NOTA: Il numero medio di cellule per questa immunoprecipitazione è 1 × 10⁷. Le cellule aderenti devono essere seminate un giorno prima dell’esperimento in modo che ci siano 1 × 10⁷ cellule il giorno dell’esperimento.

1. Preparazione delle cellule aderenti per l’esperimento
   1. Seminare 5-8 × 10⁶ cellule aderenti in 20 mL di terreno (vedere la Tabella dei materiali per la composizione) per ciascuna condizione in piatti da 14,5 cm un giorno prima dell’inizio dell’esperimento.
   2. Il giorno dell’esperimento, assicurarsi che le cellule siano confluenti all’80-90% e aderenti al piatto. Scartare il terreno e aggiungere terreno fresco alle cellule aderenti.
2. Preparazione delle celle di sospensione per l’esperimento
   1. Posizionare con cautela 1 × 10⁷ cellule in sospensione in 10 mL di terreno di coltura (vedere la Tabella dei materiali per la composizione) per condizione in piastre da 14,5 cm immediatamente prima dell’inizio dell’esperimento.
   2. Se si utilizzano cellule primarie, isolare le cellule T primarie secondo la procedura descritta in precedenza. Trattare le cellule T primarie con 1 μg/mL di fitoemoagglutinina per 24 ore, seguito da un trattamento con 25 U/mL di IL2 per 6 giorni.
   3. Posizionare con cura 1 × 10⁸ cellule T primarie in 10 mL di terreno di coltura (vedere la Tabella dei materiali per la composizione) per condizione in piastre da 14,5 cm immediatamente prima dell’inizio dell’esperimento.
      nota: Si raccomanda questo numero più elevato di cellule T primarie, poiché queste cellule sono più piccole.

2. Stimolazione CD95L

1. Stimolare le cellule con CD95L (prodotto come descritto in precedenza o disponibile in commercio (vedi Tabella dei Materiali).
   nota: La concentrazione del CD95L e il tempo di stimolazione dipendono dal tipo di cellula. Preparare due volte una condizione di stimolazione per generare un campione di “controllo del microschino” in parallelo.
   1. Stimola le cellule aderenti con la concentrazione selezionata di CD95L. Tenere la piastra inclinata e pipettare il ligando nel terreno senza toccare le cellule aderenti.
   2. Stimolare le cellule in sospensione con CD95L pipettando la soluzione del ligando nella sospensione cellulare.

3. Raccolta e lisi delle cellule

1. Metti le piastre cellulari sul ghiaccio.
   nota: Non gettare il mezzo. Le cellule morenti galleggiano nel terreno e sono importanti per l’analisi.
2. Aggiungere 10 mL di soluzione salina fredda tamponata con fosfato (PBS) alla sospensione cellulare e raschiare le cellule attaccate dalla piastra. Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da 50 mL.
3. Lavare due volte la piastra cellulare con 10 ml di PBS freddo e inserire la soluzione di lavaggio nella stessa provetta da 50 ml. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 × g per 5 min, 4 °C.
4. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare con 1 mL di PBS freddo. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 1,5 mL.
5. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 × g per 5 min, 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare con 1 mL di PBS freddo.
6. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 × g per 5 min, 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare con 1 mL di tampone di lisi (contenente un cocktail di inibitori della proteasi al 4%). Incubarlo per 30 minuti con ghiaccio.
7. Centrifugare il lisato alla massima velocità (~17.000 × g) per 15 min, 4 °C.
8. Trasferire il surnatante (lisato) in una provetta pulita. Scartare il pellet. Prelevare 50 μl di lisato in un’altra provetta. Analizzare la concentrazione proteica mediante saggio di Bradford e prelevare la quantità di lisato corrispondente a 25 μg di proteine in una fiala. Aggiungere il tampone di caricamento (vedere la Tabella dei materiali per la composizione) alla fiala. Conservarlo a -20 °C come controllo del lisato.

4. Immunoprecipitazione (IP)

1. Aggiungere 2 μL di anticorpi anti-APO-1 e 10 μL di perle di proteina A sefarosio (preparate come raccomandato dal produttore) al lisato. Aggiungere solo 10 μl delle perle a una provetta separata contenente lisato (campione stimolato) per generare un “controllo delle microsfere”
   nota: Utilizzare puntali per pipette con orifizi larghi tagliando i puntali o acquistando puntali speciali per IP mentre si maneggiano le perle di proteina A sefarosio.
2. Incubare la miscela di lisato con anticorpi/perle di proteina A sefarosio mescolando delicatamente per una notte a 4 °C. Centrifugare i lisati con anticorpi/perle di proteina A di sefarosio a 500 × g per 4 minuti, 4 °C. Scartare il surnatante, aggiungere 1 ml di PBS freddo alle perle e ripetere questo passaggio almeno tre volte.
3. Scartare il surnatante. Aspirare le perle preferibilmente con una siringa Hamilton da 50 μL.

5. Macchia occidentale

1. Aggiungere 20 μl di tampone di caricamento 4x (vedere la Tabella dei materiali per la composizione) alle perle e riscaldare a 95 °C per 10 minuti. Riscaldare i controlli del lisato a 95 °C per 5 minuti.
2. Caricare i lisati, gli IP e uno standard proteico su un gel di dodecil solfato di sodio (SDS) al 12,5% (vedere la Tabella dei materiali per la preparazione del gel) e far funzionare con una tensione costante di 80 V.
3. Trasferire le proteine dal gel SDS a una membrana di nitrocellulosa.
   nota: Qui, la tecnica semi-secca, ottimizzata per le proteine di interesse, è stata utilizzata per il trasferimento su 12 min (25 V; 2,5 A= costante). Immergere la membrana in nitrocellulosa e due pile di trasferimento di dimensioni ridotte in un tampone per elettroforesi (vedere la Tabella dei materiali per la composizione, preparare secondo le istruzioni del produttore) per alcuni minuti prima del western blotting.
4. Mettere la membrana tamponata in una scatola e bloccarla per 1 ora in una soluzione bloccante (0,1% Tween-20 in PBS (PBST) + 5% latte). Incubare la membrana con la soluzione bloccante agitando delicatamente.
5. Lavare la membrana tre volte con PBST per 5 minuti ogni lavaggio.

6. Rilevamento Western blot

1. Aggiungere il primo anticorpo primario alla diluizione indicata (vedi Tabella dei materiali) alla membrana e incubarlo per una notte a 4 °C con leggera agitazione.
2. Lavare la membrana tre volte con PBST per 5 minuti ogni lavaggio.
3. Incubare la membrana con 20 mL di anticorpo secondario (diluito 1:10.000 in PBST + 5% di latte) agitando delicatamente per 1 ora a temperatura ambiente.
4. Lavare la membrana tre volte con PBST per 5 minuti ogni lavaggio.
5. Scartare PBST e aggiungere circa 1 mL di substrato di perossidasi di rafano alla membrana.
6. Rileva il segnale chemiluminescente (vedi Tabella dei materiali).
   nota: Il tempo di esposizione e il numero di immagini acquisite dipendono dalla quantità di proteine nella cellula e dalla specificità degli anticorpi utilizzati. Deve essere stabilito empiricamente per ogni anticorpo utilizzato per la rilevazione.

Materials

12.5% SDS gel	Self-made		For two separating gels: 3.28 mL distilled H<sub>2</sub>O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 &micro;L 10% SDS 100 &micro;L 10% APS 7.5 &micro;L TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H<sub>2</sub>O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 &micro;L 10% SDS 25 &micro;L 10% APS 7.5 &micro;L TEMED
14.5 cm cell dishes	Greiner	639160
Acrylamide	Carl Roth	A124.1
Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orifice	VWR	46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe)	Used for pipetting beads to the lysate
Used for pipetting beads to the lysate	Sigma Aldrich	A2103	Dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-APO-1 Ab	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-805-038-C100	Used only for immunoprecipitation
anti-caspase-10 Ab	Biozol	MBL-M059-3	Dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-caspase-3 Ab	Cell signaling	9662 S	Dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-caspase-8 Ab C15	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-804-242-C100	Dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-CD95 Ab	Santa Cruz	sc-715	Dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-c-FLIP NF6 Ab	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-804-961-0100	Dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-FADD 1C4 Ab	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ADI-AAM-212-E	Dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-PARP Ab	Cell signaling	9542	Dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
APS	Carl Roth	9592.3
&beta;-mercaptoethanol	Carl Roth	4227.2
Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml	Bio Rad	500-0006	Used according to manufacturer's instructions
CD95L	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-522-020-C005
Chemiluminescence detector Chem Doc XRS+	Bio Rad
Complete Protease Inhibitor Cocktail (PIC)	Sigma Aldrich	ALX-522-020-C005	Prepared according to manufacturer's instructions
DPBS (10x) w/o Ca, Mg	PAN Biotech	P04-53500	Dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge
Electrophoresis buffer	Self-made		10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H<sub>2</sub>O 1:10 dilution before usage
Glycine	Carl Roth	3908.3
Goat Anti-Mouse IgG1 HRP	SouthernBiotech&nbsp;	1070-05	Dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Mouse IgG2b HRP	SouthernBiotech	1090-05	Dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Rabbit IgG-HRP	SouthernBiotech	4030-05	Dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Interleukin-2 Human (hIL-2)	Merckgroup/ Roche	11011456001	For activation of T cells
KCl	Carl Roth	6781.2
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	Carl Roth	3904.1
Loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer, 10 mL	Bio Rad	161-0747	Prepared according to manufacturer's instructions
Luminata Forte Western HRP substrate	Millipore	WBLUFO500
Lysis buffer	Self-made		13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O
Medium for adherent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L	PAN Biotech	P04-41154	Adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium
Medium for primary T cells	gibco by Life Technologie	21875034	Adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium
Milk powder	Carl Roth	T145.4
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	Carl Roth	P030.3
NaCl	Carl Roth	3957.2
PBST	Self-made		20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 8 g KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> Copyright &copy; 2021 JoVE Journal of Visualized Experiments jove.com Page 3 of 3 20 mL Tween-20 ad 2 L H<sub>2</sub>O dilution 1:20 before usage
PBST + 5% milk	Self-made		50 g milk powder + 1 L PBST
PHA	Thermo Fisher Scientific	R30852801	For activation of T Cells
Power Pac HC	Bio Rad
Precision Plus Protein Standard All Blue	Bio Rad	161-0373	Use between 3-5 &micro;L
Protein A Sepharose CL-4B beads	Novodirect/ Th.Geyer	GE 17-0780-01	Affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions
Scraper	VWR	734-2602
SDS	Carl Roth	4360.2
Shaker	Heidolph
Sodium azide	Carl Roth	K305.1
TEMED	Carl Roth	2367.3
Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks	Bio Rad	170-4270	Used according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer	Bio Rad	10026938	Prepared according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane	Bio Rad	170-4270	Used according to manufacturer's instructions
Trans-Blot-Turbo	Bio Rad
Tris	Chem Solute	8,08,51,000
Triton X-100	Carl Roth	3051.4
Tween-20	Pan Reac Appli Chem	A4974,1000