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Abstract

Fonte: Li, J., et al. Identificazione di eventi di ricombinazione omologa in cellule staminali embrionali di topo utilizzando il Southern Blotting e la reazione a catena della polimerasi. J. Vis. Exp. (2018).

In questo video, descriviamo la tecnica di Southern blotting per identificare eventi di ricombinazione omologa nel genoma di cellule staminali embrionali di topo utilizzando sonde radiomarcate. Le regioni del DNA contenenti eventi di ricombinazione omologa appaiono come bande distinte quando la membrana contenente il DNA legato alla sonda è esposta ai raggi X.

Protocol

1. Preparazione del DNA genomico e digestione con enzima di restrizione

1. Preparare gDNA da cellule staminali embrionali (cellule ES) utilizzando un kit commerciale (kit di purificazione del DNA genomico) con piccole modifiche.
   1. Rimuovere i terreni dalla coltura cellulare ES e aggiungere 500 μL di soluzione di lisi dei nuclei, inclusa la RNaseA, direttamente ai pozzetti per lisare le cellule.
      nota: Il lisato cellulare può essere conservato a -80 °C o trattato immediatamente.
   2. Pipettare su e giù più volte per lisare completamente le cellule e trasferirle in una provetta pulita da 1,5 ml.
   3. Aggiungere un terzo del volume della soluzione di precipitazione proteica alla provetta da 1,5 mL, agitare energicamente per 20 s, raffreddare i campioni su ghiaccio per 5 min, quindi centrifugare a una forza di 2.000 x g per 5 min. Trasferire il surnatante in un’altra provetta pulita da 1,5 mL contenente un volume uguale di isopropanolo; mescolare delicatamente la soluzione. (Si noti che in questo momento si possono vedere fili bianchi simili a fili.) Centrifugare ad una forza di 2.000 x g per 1 min; Quindi, scartare il surnatante.
   4. Lavare il pellet di gDNA con 1 mL di etanolo al 70% a temperatura ambiente, centrifugare a una forza di 2.000 x g per 1 minuto, aspirare accuratamente il surnatante e quindi asciugare il pellet di gDNA all’aria per 3 minuti.
   5. Sciogliere i gDNA con 100 μL di soluzione di reidratazione del DNA e, quindi, incubare a 65 °C per 1 ora o a 4 °C per una notte.
   6. Conservare i gDNA a 2-8 °C.
2. Digerire i gDNA con RE Dra I preprogettato. Impostare una reazione di digestione da 30 μl mescolando 3 μl di tampone 10x per Dra I, 3 μl di Dra I, 10 μg di gDNA/campione e H₂O fino a 30 μl e incubare a 37 °C durante la notte.
3. Verificare la completezza della digestione mediante gel di DNA, analizzando 5 μL della reazione digerita, quindi aggiungere i 3 μL di tampone di caricamento del DNA 10x per il passaggio successivo.

2. Tamponamento meridionale

1. Screening del Southern blotting
   1. Separare i gDNA digeriti mediante elettroforesi e trasferirli su una membrana.
      1. Preparare un gel per elettroforesi di agarosio all’1% con bromuro di etidio (EB), caricare i campioni di gDNA digeriti e una scala da 1 kb ed eseguire il gel a bassa tensione (30-40 V) durante la notte.
      2. Estrarre il gel e scattare una foto con un sistema di imaging su gel di DNA dopo l’elettroforesi. Controlla se i gDNA digeriti e separati mostrano un’immagine simile a uno striscio.
      3. Immergere il gel in una vaschetta con una soluzione di HCl 0,2 N e agitarlo delicatamente per 20 minuti a temperatura ambiente.
      4. Trasferire il gel in una soluzione denaturante del DNA e agitarlo delicatamente per 20 minuti a temperatura ambiente.
      5. Trasforma il gel in una soluzione neutralizzante del DNA e agitalo delicatamente per 20 minuti a temperatura ambiente.
         nota: Il gel è soggetto a rotture dopo questo passaggio, quindi deve essere maneggiato con cura.
      6. Utilizzare il sistema di trasferimento rapido verso il basso per trasferire il DNA dal gel alla membrana. Assemblare il TurboBlotter e la pila di tamponamento secondo le istruzioni fornite dal produttore.
         NOTA: Come tampone di trasferimento viene utilizzata una soluzione salina o 20 di citrato di sodio (SSC). In generale, 3 ore di trasferimento sono sufficienti per trasferire il 95% dei gDNA dal gel alla membrana; Tuttavia, un tempo di trasferimento più lungo è innocuo.
      7. Estrarre la membrana e lavarla con 2x SSC per 1 minuto, assorbire il liquido con i fazzoletti, quindi reticolare il DNA con la membrana utilizzando un reticolante UV.
         nota: La membrana può essere conservata a 4 °C per una settimana.
2. Etichettare le sonde di DNA con la radioattività.
   1. Purificare i plasmidi della sonda utilizzando un kit miniprep secondo il protocollo fornito dal produttore.
   2. Rilasciare i frammenti di DNA delle sonde dal vettore plasmidico mediante digestione EcoR I in una soluzione di reazione comprendente 5 μL di tampone per EcoR I, 2 μL di enzima EcoR I, 20 μg di DNA plasmidico e H₂O fino a 50 μL, per 2 ore.
   3. Eseguire un gel di DNA all’1% per separare i frammenti di DNA della sonda dal vettore e purificare i frammenti di DNA delle sonde con un kit di estrazione del gel di DNA secondo il protocollo fornito dal produttore.
   4. Utilizzando 1 μL della soluzione di DNA, misurare la concentrazione di DNA dei frammenti di DNA della sonda con uno spettrofotometro a una lunghezza d’onda di 260/280 nm.
   5. Preparare 40 ng di DNA sonda in una provetta da 1,5 ml con 45 μl di tampone TE, far bollire per 3 minuti, centrifugare brevemente e quindi mettere le provette sul ghiaccio per 2 minuti.
   6. Aggiungere i DNA della sonda denaturati a caldo nella provetta contenente le perle di marcatura del DNA (-dCTP) pronte all’uso, pipettare su e giù per mescolare, aggiungere 5 μL di [α³²P]dCTP e incubare a 37 °C per 15 minuti.
   7. Purificare le sonde marcate utilizzando microcolonne G-50 secondo le istruzioni fornite dal produttore e, quindi, misurare la radioattività con un contatore a scintillazione (opzionale).
3. Ibridare la/e membrana/e con le sonde marcate.
   1. Preibridare la membrana.
      1. Preriscaldare la soluzione di ibridazione a 42 °C per 30 minuti. Mescolare 20 mL di soluzione di ibridazione preriscaldata con 200 μg di DNA di sperma di salmone bollito in una provetta da 50 mL.
      2. Posizionare la membrana nel tubo di ibridazione. Aggiungere la soluzione di preibridazione mista al tubo di ibridazione. Metterlo nel forno di ibridazione (impostare la cottura e la temperatura a 42 °C) e lasciare procedere la preibridazione per 30 min.
   2. Ibridare la membrana con la/e sonda/e marcata/e.
      1. Estrarre la provetta di ibridazione e versare la soluzione di preibridazione in una provetta da 50 mL; aggiungere la sonda denaturata (riscaldata a 100 °C per 3 min) del passaggio 2.1.2.7 a questa provetta e mescolare delicatamente.
         nota: Ridurre le bolle che inducono.
      2. Rimettere la soluzione miscelata nella provetta di ibridazione ed eseguire l’ibridazione a 42 °C per una notte.
4. Lavare la/e membrana/e per rimuovere le sonde non ibridate.
   1. Mettere la/e membrana/e in una teglia con 1x SSC + 0,1% SDS e agitare delicatamente a 55–60 °C per 10 minuti.
   2. Trasferire la/e membrana/e in un vassoio con 0,5x SSC + 0,1% SDS e agitare delicatamente a 55-60 °C per 10 minuti.
   3. Controllare la radioattività sulla/e membrana/e utilizzando un contatore Geiger portatile per decidere se è necessario un terzo lavaggio.
5. Esporre la radioattività sulla membrana a pellicole radiografiche.
   1. Rimuovere il liquido dalla/e membrana/e lavata/e.
   2. Avvolgere la/e membrana/e con pellicola trasparente e fissarla nella cassetta di esposizione.
   3. Esporre la membrana a due fogli di pellicola radiografica in una camera buia.
   4. Posizionare la cassetta di esposizione a -80 °C durante la notte o più a lungo.
6. Sviluppa i filmati per visualizzare i risultati. Valutare se un clone ES corrispondente è quello desiderato con la ricombinazione mirata o meno, in base alle dimensioni delle bande di DNA rilevate dalle sonde.
7. Riibridare la stessa membrana con un’altra sonda dopo aver rimosso la sonda usata secondo la seguente procedura: estrarre la membrana usata, lavarla 1 volta con H₂O pulito, quindi incubarla in soluzione di striping (55% formammide, 2% SSPE, 1% SDS, H₂O) a 65 °C agitando delicatamente per 1-2 ore.

Materials

QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN	28704
DNA Denaturing Solution	VWR	351-013-131
DNA Neutralizing Solution	VWR	351-014-131
EcoR I	Thermo Scientific	ER0271
Dra I	Thermo Scientific	ER0221
ProbeQuan G-50 Micro Columns	GE Healthcare	28-9034-08
Hybrisol I Hybridization Solution	Millipore	S4040
Ready-To-Go DNA Labeling Beads (-dCTP)	VWR	27-9240-01
UltraPure SSC, 20x	Thermo Fisher	15557036
Salmon Sperm DNA Solution	Thermo Fisher	15632011
Whatman TurboBlotter Transfer System, Large Kits	Fisher Scientific	09-301-188
[α32P] dCTP	PerkinElmer	NEG013H100UC
Kodak X-Ray Film	Z&Z Medical	844 5702
QIAprep Spin Miniprep Kit	QIAGEN	27104
Nuclei Lysis Solution	Promega	A7941
Protein Precipitation Solution	Promega	A7951