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Abstract

Fonte: Tirumalai, V., et al. Analisi del blot di RNA per il rilevamento e la quantificazione dei microRNA vegetali. J. Vis. Exp. (2020)

In questo video, dimostriamo il northern blot, una tecnica di ibridazione per rilevare e quantificare i microRNA (miRNA) dall’RNA totale estratto dal tessuto vegetale.

Protocol

1. Elettroforesi su gel

1. Arrestare la pre-corsa e lavare i pozzetti prima del caricamento del campione.
2. Riscaldare i campioni a 98 °C per 1 minuto e caricare i campioni caldi nel pozzetto utilizzando le punte capillari. Inserire la punta sul fondo del pozzetto in modo che il campione occupi uno strato sottile nel pozzetto.
3. Caricamento completo di tutti i campioni. Includere il caricamento del marcatore del decennio dell’RNA.
4. Far funzionare il gel a 80 V fino a quando il colorante blu di bromofenolo non cola quasi completamente. Il blu di bromofenolo scorre a 10 bp in un gel di acrilammide denaturante al 15%.

2. Preparazione per l’elettro-blotting

1. Tagliare la membrana di nylon N+ alle dimensioni di una lastra di vetro ed etichettare la membrana nell’angolo in alto a destra con una matita HB.
2. Posizionare delicatamente la membrana sulla superficie dell’acqua sterile, rivoltando il lato etichettato verso la superficie dell’acqua. Pre-immergere la membrana per 15 minuti.
3. Taglia 4 pezzi di carta assorbente I nelle dimensioni di un tampone di fibra.
4. Preparare il sandwich in gel posizionando il lato grigio della cassetta in un vassoio pulito.
5. Pre-bagnare il tampone in fibra e posizionarlo sopra la cassetta. Rimuovere le bolle d’aria.
6. Pre-bagnare un pezzo di carta assorbente in 1x TBE e posizionarlo sopra il tampone in fibra. Rimuovere le bolle d’aria arrotolando una pipetta di plastica sulla carta. Stendere un altro pezzo di carta assorbente pre-bagnata e rimuovere le bolle d’aria.
7. Rimuovere con cautela il gel dalla cassetta di scorrimento e posizionarlo sopra la configurazione a sandwich, in modo che il primo campione di RNA caricato sia rivolto verso destra.
8. Immergere delicatamente la membrana pre-imbevuta in 1x TBE e posizionarla sopra il gel, rivolto verso il basso con il lato etichettato. Stendere per eliminare le bolle d’aria.
9. Immergi un pezzo di carta assorbente, adagialo sulla membrana e rimuovi le bolle d’aria. Immergi un altro pezzo di carta assorbente, posizionalo sopra la configurazione del sandwich e rimuovi le bolle d’aria.
10. Completa il sandwich posizionando un tampone in fibra pre-bagnata sopra il setup e chiudendo saldamente la cassetta.
11. Posizionare la cassetta transblot nel modulo e riempire 1x TBE, pH 8,2, fino al segno di blotting.
12. Trasferimento a 10 V, pernottamento a 4 °C.
13. Dopo il trasferimento, posizionare la membrana umida su un foglio di carta e reticolare immediatamente l’RNA alla membrana mediante irradiazione con luce UV a 254 nm (120.000 μjoule/cm²). Il blot reticolato può essere conservato a 4 °C per un’ulteriore ibridazione.

3. Preparazione della sonda radiomarcata

1. Progettare una sonda che sia completamente complementare al piccolo RNA che deve essere rilevato.
2. Etichettare la sonda utilizzando ƳP32ATP (ottenuto da BRIT) alla sua estremità 5′ combinando i componenti secondo la ricetta fornita nella Tabella 1.
3. Incubare la miscela di reazione di cui sopra a 37 °C per 30 minuti.
4. Separare l’ƳP32ATP non marcato dalla sonda utilizzando una colonna Sephadex G-25 secondo il protocollo del produttore.

4.Ibridazione del blot

1. Posizionare il blot reticolato, con il lato dell’RNA rivolto verso l’alto, all’interno di un flacone di ibridazione.
2. Miscelare energicamente il tampone di ibridazione ultrasensibile, aggiungerne 10 mL e incubare il blot all’interno di un forno di ibridazione mantenuto a 35 °C, con rotazione.
3. Eseguire la pre-ibridazione per 20 min.
4. Togliere la bottiglia dal forno e aggiungere delicatamente la sonda etichettata nel tampone di ibridazione.
5. Ibridare il blot a 35 °C, con rotazione per 12 h.
6. Dopo l’ibridazione, trasferire con cura la soluzione di ibridazione in una provetta da 15 mL. Questa soluzione può essere conservata a 4 °C fino al riutilizzo.
7. Eseguire un lavaggio rapido del blot per 2 minuti per rimuovere la soluzione di ibridazione in eccesso aggiungendo 2 tamponi SSC più 0,5% di SDS. Scartare la soluzione.
8. Incubare il blot con 2 tamponi SSC più 0,5% SDS per 35 °C, con rotazione per 30 minuti.
9. Lavare nuovamente la macchia con tampone SSC 0,5x più 0,5% SDS per 35°C, con rotazione per 30 min.
10. Posizionare la macchia all’interno di un coperchio di ibridazione, rimuovere il tampone in eccesso e sigillarlo.
11. Esporlo a uno schermo imager al fosforo privo di radiazioni durante la notte all’interno di una cassetta.
12. Rilevare il segnale di ibridazione utilizzando un imager biomolecolare e analizzare i risultati utilizzando un software adatto.

Tabella 1: Tabella delle ricette

Tampone e soluzione	ricetta	Commenti
10 X TBE	0,89 milioni di tampone Tris	pH dovrebbe essere impostato a 8.2 usando l’acido acetico
	0,89 M di acido borico
	30mM EDTA
Miscela di gel	15% acrilammide-bisacrilammide sol, 19:1	La miscela di gel non deve contenere cristalli di urea
	8M di urea
	1X TBE
Colorante a caricamento gel	0,05 % (p/v) blu di bromofenolo	Bisogna fare attenzione quando si maneggia la formammide deionizzata
	0,05 %(p/v) xilene xianolo
	100% formammide deionizzata
Etichettatura della sonda	Tampone PNK (10X, 2 μL)	Questa miscela contiene molecole radioattive, questo passaggio deve essere eseguito da personale addestrato all’interno di un laboratorio radioattivo
	Enzima PNK (1 μL)
	Oligo (100 μM, 0,1 μL)
	ƳP32 ATP (4 μL)
Wash Buffer – I	2X SSC
	0,5% (p/v) SDS
Wash Buffer – II	SSC 0,5X
	0,5% (p/v) SDS
Rimozione del buffer – I	SSC 0,5X
	0,1% (p/v) SDS
Buffer di Stripping – II	SSC 0,1X
	0,1% (p/v) SDS

Materials

40% Acrylamide-bisacrylamide solution 	Sigma 	A9926	Chemical
Ammonium persulphate (APS)	BioRad	1610700	Chemical
Blotting paper	Whatman blotting paper I	1001-125	Assay
Bromophenol blue	Sigma	B5525-5G	Chemical
Capillary loading tips	BioRad	2239915	Plastic ware
Deionized formamide	Ambion	AM9342	Chemical
Heating block 	Eppendorf	5350	Device
Hybond N+nylon membrane	GE	RPN203B	Assay
Hybridization bottle	Sigma	Z374792-1EA	Plastic ware
Hybridization Oven	Thermo Scientific	1211V79	Device
N,N,N',N'- Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma	T7024-25ml	Chemical
PhosphorImager	GE- Typhoon scanner	29187194	Device
PhosphorImager screen and cassette	GE healthcare	GE28-9564-75	Device
Pipettes	Gilson, models: P20 and P10	FA10002M, FA10003M	Plastic ware
Plastic pipette	Falcon	357550	Plastic ware
Polyacrylamide gel apparatus	BioRad	1658003EDU	Device
Sephadex G-25 column	GE healthcare	27532501	Device
Speed Vac Concentrator	Thermo Scientific	20-548-130	Device
Spinwin	Tarsons	1010	Device
T4 Polynucleotide Kinase (PNK)	NEB	M0201S	Assay
Transblot apparatus	BioRad	1703946	Device
ULTRAHyb hybridization buffer	Ambion	AM8670	Assay
Urea	Fischer Scientific	15985	Chemical
UV-crosslinker	UVP	CL-1000L	Device
Vortex	Tarsons	3020	Device
Water bath	NEOLAB	D-8810	Device
Xylene cyanol	Sigma	X4126-10G	Assay