Isolamento di cellule staminali da xenotrapianti di cancro pancreatico umano

Summary

Cellule staminali tumorali (CSC), sono stati identificati in una serie di tumori maligni. In questo protocollo si descrive un metodo di citometria a flusso utilizzando aldeide deidrogenasi attività e CD44 e CD24 espressione di isolare dal CSC xenotrapianti adenocarcinoma pancreatico umano. Queste cellule vitali possono poi essere utilizzati in studi funzionali e di analisi.

Abstract

Cellule staminali tumorali (CSC), sono stati identificati in un numero crescente di tumori maligni e sono funzionalmente definite dalla loro capacità di subire auto-rinnovamento e produrre progenie differenziata ^1. Queste proprietà consentono CSC di ricapitolare il tumore originale quando iniettato in topi immunocompromessi. CSC all'interno di un tumore epiteliale sono stati descritti nel cancro al seno e ha trovato per visualizzare specifiche espressione sulla superficie delle cellule antigene (CD44 ⁺ CD24 ^{bassa / -) 2.} Da allora, CSC sono stati identificati in un numero crescente di altre neoplasie umane usando CD44 e CD24, nonché un certo numero di antigeni di superficie. Proprietà fisiologiche, tra cui aldeide deidrogenasi (ALDH) attività, sono stati utilizzati anche per isolare dal CSC tessuti maligni ^3-5.

Recentemente, abbiamo identificato e altri CSC da adenocarcinoma pancreatico sulla base dell'attività ALDH e l'espressione degli antigeni di superficie della cellula CD44 e CD24 e CD133 ^6-8. Queste popolazioni altamente cancerogeno può o non può essere sovrapposti e visualizzare altre funzioni. Abbiamo scoperto che ALDH ⁺ e CD44 ⁺ CD24 ⁺ pancreas CSC sono ugualmente cancerogeni, ma ALDH cellule ⁺ sono relativamente più invasiva ^8. In questo protocollo si descrive un metodo per isolare praticabile pancreas CSC a basso passaggio xenotrapianti umani ^9. Tumori xenotrapiantati vengono raccolti dai topi e reso in una cella singola sospensione. Detriti tessuti e le cellule morte sono separate da cellule vive e quindi colorato utilizzando anticorpi diretti contro CD44 e CD24 e usando il reagente ALDEFLUOR, un substrato fluorescente di ALDH ^10. CSC vengono poi isolate dalla fluorescenza separazione delle cellule attivate. Isolato CSC può quindi essere utilizzata per le prove di analisi o funzionali che richiedono cellule vitali.

Protocol

1. Xenotrapianti raccolta da topi

1. Preparare la cellula dissociazione buffer: Dulbecco modificato (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino (FCS), la penicillina-streptomicina, 200 U / mL Collagenasi tipo IV, e 0,6 U / mL dispasi.
2. Un atimici (+ nu / nu +) topo ospitare un essere umano per via sottocutanea xenotrapianto cancro al pancreas che è meno di 1 cm di diametro è eutanasia per asfissia anidride carbonica e dislocazione cervicale.
3. Il tumore sottocutaneo viene raccolto dal fianco del mouse per via smussa con pinze e forbici e collocato immediatamente nel buffer cellula dissociazione.
4. I tumori sono pesati e posti di nuovo in 10 ml di cellule dissociazione tampone per 1 grammo di tessuto tumorale.

2. Generare una singola cella di sospensione dal xenotrapianti

1. Lavorare in un armadio sterile biosicurezza, il tumore viene trasferito in un piatto x 100 20 mm con la cultura 1 ml di tampone delle cellule dissociazione. I tumori sono meccanicamente tritata con lame di rasoio sterile e pinze. La sospensione delle cellule tumorali viene triturato con un 5-mL pipetta sierologica 10 volte. I pezzi del tumore dovrebbe essere abbastanza piccolo da non intasare il 5-mL pipetta sierologica.
2. La sospensione delle cellule tumorali viene trasferito in un tubo da 50 ml conica contenente il volume residuo della cellula dissociazione buffer (riempito meno del 50%) e in agitazione alla massima velocità per 1 minuto.
3. La sospensione delle cellule tumorali è quindi incubate a 37 ° C per 2 ore con vortex intermittente per 1 minuto ogni 20 minuti.

3. Riducono sospensione di cellule di detriti dei tessuti e le cellule morte

1. Dopo le 2 ore di incubazione, la sospensione cellulare è in agitazione alla massima velocità per 1 minuto.
2. La sospensione cellulare viene poi passato attraverso un filtro di 70 micron e raccolti in un nuovo tubo da 50 ml conica e portato a un volume finale di 15 ml per provetta.
3. Per ulteriori celle separate vitali dalle cellule morte e detriti dei tessuti, la sospensione delle cellule tumorali viene separata per centrifugazione densità con Ficoll-Paque Plus. Un sottostrato di Ficoll-Paque Plus è creato da pipeting 15 ml di Ficoll-Paque In più lentamente sotto la sospensione cellulare facendo attenzione a non mescolare i due strati.
4. La sospensione cellulare e gli strati Ficoll si è centrifugato a 500x g per 30 minuti con i freni spento.
5. Cellule a livello di interfaccia di Ficoll-Paque Plus e cellule tampone dissociazione sono raccolti e trasferiti ad un nuovo 50-ml tubo conico.
6. Fresco DMEM supplementato con 10% FCS si aggiunge alla sospensione cellulare di diluirlo 1:3 (es. 20 ml di mezzi freschi aggiunto a 10 ml di sospensione cellulare).
7. Le cellule vengono raccolte mediante centrifugazione a 450x g per 10 minuti, i media decantato, e il pellet cellulare viene risospeso in 1 ml di tampone ALDEFLUOR.
8. Dieci microlitri di sospensione cellulare viene diluito con 10 L trypan blu e cellule vitali vengono conteggiati utilizzando un emocitometro. Se un gran numero di cellule morte o frammenti di tessuto sono noti in questa fase, poi separazione cellulare mediante centrifugazione densità può essere ripetuto (passi 3,3-3,7).

4. Macchia Celle per fluorescenza ordinamento cellulare attivo

1. Etichetta sette 12 x 75 mm provette di polistirene come segue:
   1. Senza macchia
   2. CD44-APC
   3. CD24-PE
   4. topo CD31-biotina + mouse lignaggio-biotina + mouse H-2Kd-biotina
   5. ALDEFLUOR
   6. ALDEFLUOR DEAB + + IgG _2bκ-APC + IgG _2aκ-PE
   7. ALDEFLUOR + CD44 + CD24-APC-PE + mouse + CD31-biotina-biotina lignaggio del mouse + mouse H-2Kd-biotina.
2. Diluire la sospensione di cellule in 2 ml di tampone ALDEFLUOR ad una concentrazione finale di 5-10 milioni di cellule / ml e tenere in ghiaccio. Aggiungere 100 microlitri della sospensione cellulare ai tubi # 1, 2, 3 e 4 e tenerli su ghiaccio. Aggiungere 1 DEAB microlitri per tubo # 6 e tenere in ghiaccio. Aggiungere il reagente ALDEFLUOR alla sospensione cellulare residua diluita 1000 – volte (ad esempio aggiungere 1,6 microlitri di reagente ALDEFLUOR a 1,6 ml di sospensione cellulare), mescolare bene, e posto sul ghiaccio. Trasferire 100 ml di questa miscela a tubi # 5 e 6, e la miscela rimanente (1,4 ml) al tubo # 7. Incubare tutte le provette in un bagno d'acqua a 37 ° C per 40 minuti. Mescolare la sospensione cellulare ogni 10 minuti per evitare che le cellule di assestamento al fondo dei tubi.
3. Centrifugare le cellule a 450x g e 4 ° C per 10 minuti e poi decantare il buffer. Risospendere il pellet in tubi # 1 e 5 in 100 microlitri di buffer ALDEFLUOR. Per tubi # 2, 3, 4 e 6, aggiungere 100 ml di tampone ALDEFLUOR contenente gli anticorpi adeguati diluita come segue: 1:20 per IgG _2bΚ-APC, IgG _2aΚ-PE, CD44-APC, e CD24-PEanticorpi; 1:100 per mouse CD31-biotina, mouse lignaggio-biotina, mouse e H-2Kd-biotina anticorpi. Per tubo # 7 aggiungere 1,4 ml di tampone ALDEFLUOR contenente una diluizione 1:20 di CD44-APC, e anticorpi CD24-PE e una diluizione 1:100 del mouse CD31-biotina, mouse lignaggio-biotina, e mouse H-2Kd-biotina anticorpi. Incubare le sospensioni delle cellule in ghiaccio per 10 minuti.
4. Centrifugare le cellule a 450x g e 4 ° C per 10 minuti e poi decantare il buffer. Risospendere il pellet in tubi # 1, 2, 3, 5, e 6 in 100 microlitri di buffer ALDEFLUOR. Preparare 1,5 mL di tampone ALDEFLUOR contenente una diluizione 1:100 di streptavidina-PerCP proteine. Aggiungere 100 ul a tubo # 4 e aggiungere 1,4 ml di tubo # 7. Incubare le sospensioni delle cellule in ghiaccio per 10 minuti.
5. Centrifugare le cellule a 450x g e 4 ° C per 10 minuti e poi decantare il buffer. Risospendere il pellet in tubi # 1, 2, 3, 4, 5, e 6 in 200 microlitri di buffer ALDEFLUOR. Risospendere il pellet in tubo # 7 in 2,8 mL di tampone ALDEFLUOR contenente 2 mg / ml di ioduro di propidio. Sì che le tubature su ghiaccio in ogni momento.
6. Passano attraverso le cellule di 35 micron con filtro 12 x 75 mm provette di polistirene con tappi filtro.

5. Isolate cellule staminali del cancro da fluorescenza ordinamento cellulare attivo

1. Un citofluorimetro FACSAria è pronto per l'ordinamento delle cellule.
2. Controlli di compensazione sono impostate utilizzando cellule di tubi # 1, 2, 3, 4 e 5.
3. Gates vengono creati in base al futuro e side-scatter parametri per la raccolta delle cellule singoletti.
4. Senza mouse (PerCP-negativo) e vitali (non macchiato ioduro di propidio) le cellule sono gated utilizzando il FL-3 canali.
5. ALDH cellule ⁺ sono raccolti sulla base di cancelli creati utilizzando DEAB cellule trattate (tubo # 6) e la FL-1 canale.
6. Cellule CD44 ⁺ CD24 ⁺ sono raccolti sulla base di cancelli creati utilizzando cellule colorate con ALDEFLUOR, IgG _2bΚ-APC, e IgG _2aκ-PE (tubo # 6) utilizzando il FL-4 e FL-2 canali.
7. Le cellule sono raccolte in 12 x 75 mm in polistirene tubi di prova contenente 1 ml di DMEM supplementato con 10% FCS.
8. Dopo che le cellule sono state ordinate, centrifuga la sospensione cellulare a 450x g per 10 minuti, decantare i media, e sospendere nuovamente le cellule in 500 microlitri DMEM fresca supplementato con 10% FCS.
9. Contare il numero di celle ordinate usando un emocitometro come descritto al punto 3.8.

6. Rappresentante Risultati

Questo protocollo porterà all'isolamento di ALDH ⁺ e CD44 ⁺ CD24 ⁺ pancreas CSC. La percentuale di cellule di topo derivati ​​è variabile, ma abbiamo trovato che la maggior parte xenotrapianti cancro al pancreas umano contiene 20-60% di cellule di topo derivate usando il mouse CD31, cocktail lignaggio del mouse, mouse e H-2Kd biotina anticorpi coniugati (Figura 1A ). Allo stesso modo la frequenza di ogni popolazione CSC da diversi xenotrapianti è variabile, ma in generale abbiamo trovato che il 1-4% della popolazione totale di cellule è ALDH ⁺ (Figura 1B) e 0,2-5% è CD44 ⁺ CD24 ⁺ (Figura 1C).

Noi abitualmente manualmente contare le celle ordinate usando un emocitometro quanto i conteggi macchina FACSAria sono spesso imprecisi a causa della non-cellulari particelle rilevato dal FACSAria.

Figura 1. Citometria a flusso trama raffigurante popolazioni specifiche di trapianto di cancro al pancreas. (A) Cellule colorazione positivamente nella FL-3 canali (propidio ioduro ^+, CD31 ^{+ +} topo lignaggio del mouse, o il mouse H-2Kd ⁺⁾ sono esclusi in modo da isolare solo vitali e non topo cellule derivate. (B) l'attività ALDH in caso di trapianto di cancro pancreatico umano è stato misurato mediante citometria di flusso utilizzando il reagente ALDEFLUOR in presenza e in assenza di inibitore ALDH1 dietilammino-benzaldeide (DEAB). I telai rappresentano cancelli che raffigurano le cellule ⁺ ALDH che sono stati creati sulla base di cellule trattate con DEAB e poi applicata a cellule non trattate. Le percentuali di cellule ⁺ ALDH sono riportati nella porta. (C) La CD44 ⁺ CD24 ⁺ cancello è stato creato sulla base di cellule colorate con ALDEFLUOR, e IgG _2bκ-APC (controllo isotipico per CD44-APC) e IgG _2aκ-PE (controllo isotipico per CD24-PE) gli anticorpi. Le percentuali di cellule CD44 ⁺ CD24 ⁺ sono mostrati in porta.

Discussion

Questo protocollo descrive l'isolamento di pancreas da CSC xenotrapianti umani. Diversi passaggi chiave di questa procedura sarà migliorare il rendimento di validi CSC. Il recupero di una popolazione pura di pancreas CSC dipende dalla purezza delle cellule vitali presenti nella sospensione cellulare prima di ordinare sul FACSAria. Avendo cura di utilizzare xenotrapianti che sono meno di 1 cm di diametro aiuta a ridurre la quantità di tessuto necrotico nel centro del tumore. Inoltre, riducono la sospensione di cellule di detriti tessuti e cellule morte durante Ficoll-Paque centrifugazione gradiente è critica e può essere ripetuto se un gran numero di detriti dei tessuti o cellule non vitali vengono rilevati quando le cellule si contano sulle emocitometro.

Il protocollo di colorazione descritta qui utilizza il sistema reagente ALDEFLUOR per rilevare l'attività ALDH così come fluoroforo anticorpi coniugati per rilevare specifici antigeni di superficie delle cellule. ALDEFLUOR colorazione è eseguita a 37 ° C e, quindi, deve essere completata prima della colorazione degli anticorpi (su ghiaccio) per evitare il rischio di anticorpi tappatura, che può avvenire a 37 ° C. Dato che le cellule possono efflusso il reagente ALDEFLUOR, è importante mantenere le cellule in ALDEFLUOR tampone a 4 ° C dopo la colorazione ALDEFLUOR è stata completata. Il buffer ALDEFLUOR contiene un inibitore di efflusso di farmaco che aiuta a mantenere i livelli intracellulari di ALDEFLUOR.

Poiché questo metodo praticabile isola pancreatica CSC possono essere applicate in un certo numero di esperimenti che misurano la funzione fisiologica di queste cellule. Abbiamo usato queste cellule per tumore-iniziazione test utilizzando topi immunocompromessi e in vitro delle cellule migrazione / invasione saggi. Inoltre, RNA, DNA e proteine ​​possono essere raccolti da queste cellule per studi analitici confronto CSC e non CSC popolazioni.

Materials

DMEM	Invitrogen	11965-118
Fetal calf serum	Harlan Laboratories	BT-9501
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Collagenase type IV	Invitrogen	17104-019
Dispase	Sigma-Aldrich	D4818
100 x 20 mm culture dish	BD Biosciences	353003
70-μm filter	BD Biosciences	352350
50-mL conical tube	BD Biosciences	352070
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
ALDEFLUOR reagent system	Stem Cell Technologies	01700
Trypan blue	Invitrogen	15250-061
12 x 75 mm polystyrene test tubes	BD Biosciences	352054
CD44-APC (clone G44-26)	BD Biosciences	559942
CD24-PE (clone ML5)	BD Biosciences	555428
Mouse CD31-biotin	BD Biosciences	553371
Mouse lineage-biotin	Miltenyi Biotec	130-092-613
Mouse H-2Kd-biotin	BD Biosciences	553564
IgG<sub>2bκ</sub>-APC	BD Biosciences	555745
IgG<sub>2aκ</sub>-PE	BD Biosciences	555574
Streptavidin-PerCP protein	BD Biosciences	554064
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	P4170
12 x 75 mm polystyrene test tubes with strainer caps	BD Biosciences	352235