Misure del flusso di ossigeno per valutare la respirazione mitocondriale in cellule viventi e permeabilizzate

1. Aggiunta di cellule HEK 293T alla camera di respirometria ad alta risoluzione

1. Aggiungere il terreno di respirazione mitocondriale MiR05 nella camera pulita di Oroboros. Chiudere la camera inserendo il tappo e aspirare il fluido in eccesso dal recipiente del tappo utilizzando il sistema di aspirazione.
2. Per aggiungere le cellule HEK 293T alla camera mediante sostituzione parziale del volume, calcolare il volume della sospensione cellulare necessaria per raggiungere una concentrazione sperimentale di 1 milione/mL.
3. Rimuovere il tappo dalla camera.
4. Prelevare un volume di MiR05 dalla camera corrispondente al volume calcolato della sospensione madre utilizzando una pipetta.
5. Risospendere accuratamente la sospensione cellulare con una pipetta.
6. Aggiungere il volume calcolato della sospensione della cella madre alla camera.
   NOTA: La camera di respirometria deve essere pulita e riempita con MiR05, il sensore polarografico di ossigeno deve essere calibrato a temperatura stabile e un protocollo di titolazione SUIT (Substrate-Uncoupler-Inhibitor) deve essere caricato in anticipo nel software DatLab. La concentrazione sperimentale del campione/cellula può variare a seconda del campione specifico o del tipo di cellula. La Figura 1 mostra un esempio di respirometria ad alta risoluzione delle cellule HEK 293T.
7. Chiudere la camera inserendo il tappo e assicurandosi che non rimangano intrappolate bolle all'interno della camera.
   1. Aspirare il liquido in eccesso dal recipiente del tappo.
8. Attendere la stabilizzazione del flusso di ossigeno, che in genere richiede circa 15 minuti.

2. Manipolazione di microsiringhe

1. Preparare le microsiringhe.
   1. Selezionare e pulire la microsiringa appropriata in base al tipo di sostanza chimica e al volume da titolare. Posizionare la microsiringa sul rack delle siringhe.
   2. Riempire la siringa, facendo attenzione a evitare di includere bolle di gas.
      NOTA: Se si formano bolle di gas, eliminarle muovendo più volte lo stantuffo lentamente verso l'alto e rapidamente verso il basso.
2. Controllare il protocollo SUIT per il volume richiesto della sostanza chimica da titolare.
   1. Riempire la siringa con almeno 1 μL in più rispetto al volume richiesto.
   2. Premere lo stantuffo fino a raggiungere il segno desiderato sul cilindro di vetro, assicurandosi che appaia una piccola goccia sulla punta dell'ago (adescamento).
   3. Asciugare la goccia sulla parete del flaconcino di sostanze chimiche prima di procedere con la titolazione.

3. Titolazione delle sostanze chimiche secondo il protocollo SUIT

1. Titolare le sostanze chimiche indicate dal protocollo SUIT.
   NOTA: Apri la finestra dell'evento DatLab facendo clic sull'evento nella barra laterale del protocollo prima di titolare.
   1. Inserire completamente l'ago attraverso il capillare del tappo fino a quando la terminazione del fusto di vetro non è a contatto con il tappo.
   2. Iniettare rapidamente la sostanza chimica nella camera. ​
      NOTA: Dopo un'iniezione, un artefatto di titolazione rapida e transitoria può apparire come un picco nel flusso di O₂ (Figura 2A).
   3. Aggiungere digitonina a una concentrazione finale di 5 μg/mL.
      CAUTELA: La digitonina è tossica se ingerita.
   4. Fare clic su OK nella finestra dell'evento per impostare l'evento corrispondente.
   5. Aspirare il liquido in eccesso dal recipiente del tappo.
   6. Attendere la stabilizzazione del flusso di ossigeno e registrare per almeno 2 minuti.
   7. Aggiungere il piruvato alla camera per raggiungere una concentrazione finale di 5 mM. Fare clic su OK nella finestra dell'evento per impostare l'evento corrispondente.
      NOTA: Eseguire la titolazione successiva senza indugio.
   8. Aggiungere il malato subito dopo il piruvato fino a raggiungere una concentrazione finale di 2 mM. Fare clic su OK nella finestra dell'evento per impostare l'evento corrispondente.
   9. Aspirare il liquido in eccesso dal recipiente del tappo, attendere la stabilizzazione del flusso e registrare per circa 2 minuti.
   10. Aggiungere adenosina difosfato (ADP) a una concentrazione finale di 2,5 mM. Fare clic su OK nella finestra dell'evento per impostare l'evento corrispondente.
   11. Aspirare il liquido in eccesso dal recipiente del tappo, attendere la stabilizzazione del flusso e registrare per circa 2 minuti.
       NOTA: Dopo l'aggiunta di ADP, il flusso può continuare ad aumentare lentamente, impiegando fino a 20 minuti per stabilizzarsi.
   12. Aggiungere il cianuro di carbonile m-clorofenilidrazone (CCCP) con incrementi di 0,5 μM per raggiungere il flusso massimo. Fare clic su OK nella finestra degli eventi per impostare l'evento corrispondente dopo ogni titolazione.
       CAUTELA: La CCCP è tossica se ingerita.
       NOTA: Eseguire le titolazioni CCCP in serie rapida (intervalli di circa 1,5 minuti). Interrompere la titolazione quando l'aggiunta successiva non aumenta ulteriormente il flusso. Modificare il nome di ciascuna titolazione CCCP nella finestra degli eventi sostituendo * con la concentrazione cumulativa di CCCP.
   13. Aspirare il liquido in eccesso dal recipiente del tappo e registrare per circa 2 minuti.
   14. Aggiungere l'antimicina A per raggiungere una concentrazione finale di 2,5 μM.
       CAUTELA: L'antimicina A è fatale se ingerita.
       NOTA: Il tempo di risposta può variare a seconda del campione.
   15. Aspirare il liquido in eccesso dal recipiente del tappo e registrare per circa 2 minuti.
   16. Fare clic sul pulsante Interrompi misurazione.

4. Analisi dei dati

1. Analizza i dati.
   1. Impostare i segni sulle sezioni stabili e rappresentative del grafico del flusso.
      NOTA: Evitare di includere artefatti di titolazione nell'analisi delle tracce (Figura 2B).
2. Seleziona Indicatori dal menu in alto, quindi scegli Statistiche indicatori. Seleziona la modalità statistica desiderata e fai clic su Copia negli appunti per trasferire i dati per ulteriori analisi.

Figura 1: Respirometria ad alta risoluzione delle cellule HEK 293T. Traccia della concentrazione di O2 [μM] (linee blu) e del flusso di O2 volume-specifico [pmol∙s-1∙mL-1] (linee rosse; corrette per il flusso di fondo strumentale di O2 ; i picchi causati dalle titolazioni sono stati eliminati). SUIT-002_O2_ce-pce_D007 è un protocollo esteso e include l'aggiunta di cellule ce1, la respirazione di routine R delle cellule viventi. +Dig, digitonina 10 μg·mLL-1; permeabilizzazione delle membrane plasmatiche (da CE a PCE), respirazione endogena residua ren. +D, ADP 2,5 mM stimola il consumo residuo di substrato endogeno. +M.1, malato 0,1 mM e 1Oct, ottanoilcarnitina 0,5 mM; capacità OXPHOS della via F, 1c, citocromo c 10 μM; test per l'integrità della membrana esterna mitocondriale, 2M2, malato 2 mM che supporta la via N anaplerotica; F(N)P. 3P e 4G, piruvato 5 mM e glutammato 10 mM, attivazione progressiva a FNP. 5S, succinato 10 mM, FNSP. 6Gp, glicerofosfato 10 mM, FNSGpP. 7U4.5, titolazioni disaccoppiatrici alla concentrazione ottimale di CCCP 4,5 μM; FNSGpE. 8Rot, rotenone 0,5 μM SGpE. 9Ama, antimicina A 2,5 μM, rox. 10AsTm, ascorbato 2 mM e TMPD 0,5 mM, flusso O2 fuori scala 121 pmol·sL-1·mLL-1. 11Azd, azide 200 mM, fondo chimico capb. Concentrazione di celle 1 milione per mL, mezzo MiR05, temperatura 37 °C. La concentrazione di ossigeno è stata mantenuta al di sopra di 60 μM mediante riossigenazioni intermittenti (aria, camera aperta, tonalità blu).

Figura 2: Protocollo semplificato di titolazione SUIT (substrate-uncoupler-inhibitor-titration) con cellule HEK 293T per evidenziare la tempistica appropriata delle titolazioni chimiche. (A) mostra i picchi causati dalle titolazioni, che vengono eliminati in (B). Tracce sovrapposte di flusso di O2 per volume [pmol∙s-1∙mL-1] per la camera A (linea magenta) e la camera B (linea verde). Aggiunta di cellule (ce1) e misurazione della respirazione di routine R. +Scavare, titolare la digitonina 5 μg·mL-1 per permeabilizzare la membrana plasmatica (da ce a pce) e misurare la respirazione endogena residua ren. 1PM, aggiunta nella sequenza stretta di piruvato (5 mM) e malato (2 mM) per stimolare la respirazione NL di LEAK con via N. 2D, addizione di ADP 2,5 mM; Capacità OXPHOS della via NP. 3U5, titolazioni rapide del disaccoppiatore a passi di 0,5 μM per raggiungere la concentrazione ottimale di CCCP; Capacità ET collegata al NADH NE. 4Ama, titolazione dell'antimicina A 2,5 μM per valutare il consumo di ossigeno residuo rox. Concentrazione cellulare 1 milione/mL, mezzo MiR05, temperatura 37 °C