Saggio di trapianto di cuscinetti adiposi ovarici: una tecnica in vivo per introdurre cellule nel cuscinetto adiposo ovarico in modelli murini

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Trapianto di cuscinetti adiposi ovarici

NOTE: Disinfetta gli strumenti tra un intervento chirurgico e l'altro. Preparare e organizzare tutta l'attrezzatura in anticipo. I trapianti dorsali sul cuscinetto adiposo ovarico destro sono preferenziali in quanto ciò evita la milza. Tuttavia, i riceventi possono avere trapianti in entrambi i cuscinetti adiposi ovarici.

1. Utilizzare topi singenici o topi immunodeficienti combinati gravi (SCID/NCr) come destinatari di cellule primarie. Per le cellule umane, come le cellule HIO118, utilizzare topi Nod/SCID/gamma (NSG) o topi SCID.
2. Anestetizzare il topo ricevente con una singola iniezione intraperitoneale di 2,2,2-tribromoetanolo alla dose di 0,15 ml/10 g di peso corporeo. Posizionare l'animale su un termoforo nel cappuccio dell'animale e confermare la corretta anestesia perdendo il riflesso del pedale (pizzicamento delle dita). Applicare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza mentre l'animale è sotto anestesia. Iniettare l'animale per via sottocutanea con l'analgesico Ketoprofene a un dosaggio di 4 mg/g di peso corporeo per trattare il dolore post-chirurgico.
   In alternativa, utilizzare l'isoflurano per l'anestesia. Posizionare l'animale nella camera di induzione e regolare il flussometro di ossigeno a 0,8-1,5 L/min e il vaporizzatore di isoflurano al 2-3%. Rimuovere l'animale anestetizzato dalla camera, lasciarlo respirare isoflurano da una maschera e impostare il flussometro di ossigeno a 0,4-0,8 L/min e il vaporizzatore di isoflurano all'1,5%, quindi iniziare l'intervento chirurgico.
3. Radere l'area chirurgica con un tagliacapelli #40; rimuovere i peli da un sito due volte l'area chirurgica, preparare la pelle rasata con tre scrub antisettici di iodio povidone, seguiti da etanolo al 70%, e coprire con un telo sterile.
4. Spostare l'animale sotto un microscopio da dissezione situato in una cabina di biosicurezza. Esporre il tratto riproduttivo mediante un'incisione in posizione dorsomediale direttamente sopra il cuscinetto adiposo ovarico.
   FASE CRITICA: L'incisione precisa della pelle facilita la guarigione della ferita; Si consiglia l'uso di un bisturi al punto 1.4.
5. Usando una pinza smussata sottile, tirare con cautela il cuscinetto adiposo ovarico attraverso l'incisione verso la linea mediana, riducendo al minimo i danni ai nervi e ai principali vasi sanguigni><. PASSAGGIO CRITICO: Se si verifica un'emorragia, interrompere l'intervento chirurgico e prendere in considerazione il trapianto in un altro animale ospite.
6. Sotto il controllo del microscopio da dissezione con l'aiuto di un ago smussato calibro 28, praticare un'incisione profonda 2-4 mm nel cuscinetto adiposo ovarico, 3-4 mm sopra l'ovaio.
   CFASE RITICA: Assicurarsi che l'incisione attraversi solo metà del cuscinetto adiposo; La perforazione fino al lato inferiore provoca perdite. Sii veloce e procedi senza indugio dopo questo passaggio.
7. Per i trapianti di cellule, riempire una siringa (ago calibro 30) con 10-20 μl della miscela di matrice della membrana cellulare-basale e iniettarla nell'incisione del cuscinetto adiposo. Per il trapianto di tuba uterina, prelevare la tuba uterina con una pinza fine e posizionarla in una matrice di membrana basale da 10-20 μL mantenuta in ghiaccio. Utilizzando un puntale con filtro graduato XL da 0,1-10/20 μL (accorciato di 3 mm), prelevare la sospensione del tessuto e della matrice della membrana basale e rilasciarla nell'incisione del cuscinetto adiposo.
8. Attendere 5 minuti affinché la matrice della membrana basale si solidifichi e riposizionare il tratto riproduttivo nel peritoneo. Chiudere i muscoli con due punti di sutura chirurgica e la pelle con due piccole clip per ferite o suture chirurgiche.
9. Ripetere i passaggi 1.4-1.8 per trapiantare una miscela di matrice di membrana PBS-basale nel cuscinetto adiposo controlaterale dell'animale, che fungerà da cuscinetto adiposo di controllo.
   PASSAGGIO CRITICO: Dopo l'intervento, posizionare l'animale su un termoforo perché la perdita di calore è rapida nei topi anestetizzati.
10. Lascia che l'animale si riprenda su un termoforo nella gabbia nativa e osserva l'animale fino a quando non si sveglia completamente dall'anestesia. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico in compagnia di altri animali fino a quando non si è completamente ripreso.
11. Metti una manciata di pellet di cibo pre-umido all'interno della gabbia oltre al cibo secco sulla gabbia dopo l'intervento chirurgico. Applicare analgesici post-chirurgici, se necessario, per i giorni successivi ed esaminare la ferita quotidianamente. Applicare antibiotici secondo il protocollo approvato per gli animali in caso di infezione della ferita. Rimuovere le clip della ferita dieci giorni dopo l'intervento chirurgico, quando la ferita si è completamente chiusa.