Inoculazione ortotopica di cellule di cancro ovarico nell'ovaio murino: una procedura per stabilire un modello murino di cancro ovarico per studiare la disseminazione peritoneale delle cellule

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione delle sospensioni cellulari

1. Linea cellulare di carcinoma ovarico a cellule chiare umano
   1. Mantenere le cellule ES-2 in terreno RPMI-1640 con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e penicillina/streptomicina (penicillina: 100 unità/mL, streptomicina: 0,1 mg/mL). Colture di cellule a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO₂.
   2. Raccogliere le cellule nella fase di crescita logaritmica in una soluzione di tripsina allo 0,05% e EDTA allo 0,02% (tripsina/EDTA).
      1. Per prima cosa, rimuovere il vecchio terreno dal recipiente di coltura cellulare, quindi lavare le cellule una volta con PBS (PBS senza Ca²⁺/Mg²⁺,3-4 mL per 25 cm²).
      2. Quindi, aggiungere 1 ml per 25 cm² di tripsina/EDTA. Ruotare il recipiente di coltura cellulare per coprire il monostrato cellulare con tripsina/EDTA. Dopo aver rimosso ed eliminato la tripsina/EDTA, rimettere il recipiente di coltura cellulare nell'incubatore per 3-5 minuti o fino a quando le cellule non si sono staccate.
      3. Esaminare le cellule al microscopio per assicurarsi che le cellule siano staccate dalla superficie del recipiente di coltura cellulare e galleggino.
      4. Aggiungere un terreno di coltura fresco contenente siero per inattivare la tripsina (5 ml per 25 cm²) e risospendere le cellule. Trasferire le cellule risospese in una provetta conica da 15 mL.
      5. Centrifugare a 300 x g per 5 min. Eseguire la centrifugazione a 4 °C o a temperatura ambiente. Rimuovere con cura il surnatante e risospendere le cellule con il terreno di crescita (5 ml per 25 cm²).
   3. Contare le cellule (ad esempio, mediante esclusione del tripano-blu), quindi risospendere nel mezzo di crescita a una densità di 2 x 10⁸ cellule/mL. Mettere le celle sospese sul ghiaccio.
2. Scongelare le aliquote di idrogel congelate a base di matrice extracellulare (ECM) in un bagno di ghiaccio.
3. Aggiungere la sospensione cellulare alle aliquote di idrogel a base di ECM con un rapporto di 1:1 (concentrazione cellulare finale: 1 x 10⁵ cellule/μL di idrogel a base di ECM media) e mescolare accuratamente. Mettere le sospensioni cellulari preparate in un bagno di ghiaccio fino al momento dell'uso.

2. Inoculazione ortotopica con sospensioni cellulari

NOTA: La chirurgia non richiede una suite dedicata. L'intervento chirurgico può essere eseguito su un banco di lavoro da laboratorio in un'area della stanza separata e con un'attività minima. Può essere utilizzata anche una cappa laminare. Devono essere utilizzati strumenti chirurgici sterili e non devono essere utilizzate forbici per eseguire incisioni cutanee.

1. Utilizzare topi nudi femmina (BALB/c nu/nu) a 8 settimane di età per questo modello di inoculazione ortotopica.
2. Innanzitutto, anestetizzare il topo per inalazione di isoflurano (2-4%). Controllare la profondità dell'anestetico verificando la mancanza di ritiro in caso di fermo pizzicamento delle dita. Dopo che il topo è stato anestetizzato, applicare un blando unguento oftalmico sterile sugli occhi per prevenire l'essiccazione se necessario.
3. Posizionare il topo anestetizzato su un tavolino operatorio, con la pancia rivolta verso il basso. Disinfettare più volte l'area chirurgica sia con alcool che con uno scrub a base di iodio o clorexidina.
4. Praticare un'incisione di 2 cm verticalmente vicino alla colonna vertebrale tra l'arco costale destro e il femore. Utilizzare un telo chirurgico sterile attorno al sito dell'incisione. Fissare le superfici della pelle incisa con morsetti per mantenere l'apertura.
   nota: I divaricatori possono essere utilizzati al posto dei morsetti.
5. Successivamente, praticare una seconda incisione (circa 1 cm) al peritoneo parietale sotto la prima incisione per aprire la cavità addominale. Clamp le superfici addominali incise. Tagliare il tessuto adiposo che circonda l'ovaio omolaterale e le tube di Falloppio con una pinza per rimuovere l'ovaio dalla cavità addominale. Posizionare con cura l'ovaio e le tube di Falloppio su una garza. Quindi, posiziona il topo con la pancia rivolta verso il basso sotto il microscopio da dissezione.
6. Posizionare la sospensione cellulare in una siringa da insulina (1/2 cc, 29 G) appena prima dell'iniezione. Iniettare con cautela la sospensione cellulare preparata (1-2 μL) nell'ovaio. Per alcuni secondi, trattenere l'ago all'interno dell'ovaio per garantire la gelificazione dell'idrogel a base di ECM. Dopo la gelificazione, le cellule tumorali iniettate rimangono all'interno dell'ovaio.
7. Rimettere con cura l'ovaia nel corpo. Sutura la seconda incisione con seta medica sterile e quindi sigillatura della pelle con clip per ferite.
8. Dopo l'intervento chirurgico, ai topi verrà somministrata analgesia (ad es. meloxicam, intramuscolare o sottocutanea, 0,2 mg/kg) per un periodo iniziale di 24 ore.