Iniezione endovenosa di cellule tumorali nella vascolarizzazione della membrana corioallantoica di pollo: una procedura per stabilire un modello di cancro della membrana corioallantoica per studiare l'invasione e le metastasi del cancro

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione delle cellule tumorali per l'iniezione

NOTA: La selezione delle colonie metastatiche si basa su un fenotipo stabilito da cellule tumorali fluorescenti, derivato da una libreria di espressioni o da un vettore marcato con proteine fluorescenti come la proteina fluorescente verde o rossa (vedere l'intero flusso dello schermo nella Figura 1A). Non è consigliabile utilizzare cellule trasfettate transitoriamente con proteine fluorescenti o marcate con coloranti fluorescenti permeabili alle cellule a causa del rapido sbiadimento del segnale causato dalla proliferazione delle cellule tumorali e dalla colorazione non uniforme.

1. Coltura di cellule tumorali al 60-70% di confluenza al momento dell'iniezione. L'uso di cellule tumorali a livelli più elevati di confluenza ridurrà la loro vitalità, con conseguente bassa efficienza della formazione di colonie metastatiche. Assicurarsi che le cellule tumorali utilizzate siano prive di micoplasmi poiché la contaminazione da micoplasma può portare a una diminuzione della vitalità dell'embrione di pollo.
2. Sciacquare le celle due volte con 1x PBS, pH 7,4. Rimuovere il PBS rimanente, quindi aggiungere lo 0,5% di tripsina-EDTA e incubare a 37 °C per 2-5 minuti fino a quando tutte le cellule non sono state sollevate dalla superficie della piastra di coltura.
3. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL e centrifugare le celle a temperatura ambiente a 200 x g per 5 minuti.
4. Risospendere le cellule in 10 mL di PBS e centrifugare nuovamente le cellule come al punto 1.3, per rimuovere la tripsina e altri componenti dei terreni di coltura come gli antibiotici.
   nota: La presenza di tripsina o di componenti di colture cellulari come gli antibiotici nella sospensione delle cellule tumorali può comportare una diminuzione della vitalità dell'embrione di pollo.
5. Aspirare con cura il surnatante e risospendere le cellule con 1 mL di PBS ghiacciato.
6. Contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro o qualsiasi altra apparecchiatura per il conteggio delle cellule disponibile.
   nota: Questo protocollo di screening richiede che ogni colonia metastatica sia avviata da una singola cellula. Quando si contano le cellule, assicurarsi che le cellule siano completamente tripsinizzate ed esistano come una sospensione di una singola cellula (non sono presenti grumi di cellule).
7. Per l'iniezione endovenosa (IV), concentrare le cellule a 0,5 x 10⁶ – 1,0 x 10⁶ cellule/mL. Utilizzare 1x PBS ghiacciato per diluire e/o risospendere i concentrati cellulari. Aspettatevi che sarà necessario circa 1 mL di sospensione cellulare per ogni dieci embrioni.
   nota: La concentrazione necessaria della sospensione cellulare in sospensione è determinata principalmente dal livello di esperienza dello sperimentatore. Si prega di consultare la sezione successiva per maggiori dettagli.

2. Iniezione endovenosa di cellule tumorali per la formazione di colonie metastatiche

NOTA: Seguendo questo protocollo, è possibile iniettare fino a cento embrioni in un giorno. In genere ci vuole più tempo per isolare le colonie metastatiche che per iniettare le cellule tumorali e, pertanto, si consiglia di eseguire un esperimento iniziale per stimare il tempo necessario per completare tutti i passaggi. L'uso di etichette fluorescenti differenziali per cellule tumorali aiuta a ridurre il numero di animali e il tempo necessario per ogni esperimento. Ad esempio, le cellule di controllo possono essere marcate con RFP (proteina fluorescente rossa) mentre le cellule tumorali mutanti possono essere marcate alternativamente con GFP (proteina fluorescente verde). In questo caso, ogni esperimento ha un controllo incorporato che corregge la variabilità tra gli embrioni.

1. Assemblare l'apparato di iniezione come mostrato nella Figura 1B. Per prima cosa, montare un ago sulla siringa e poi estendere l'ago della siringa con un tubo lungo 3-5 cm.
2. Rompere la punta dell'ago in borosilicato utilizzando la pinza fine (~20–60 μL di larghezza).
3. Caricare la siringa con la sospensione di cellule tumorali (50-200 μL) e inserire l'ago in borosilicato nel tubo (Figura 1B).
4. Ispezionare l'ago in borosilicato per verificare la presenza di ostruzioni cellulari e bolle d'aria. È fondamentale iniettare le cellule come una singola sospensione cellulare per garantire che ogni colonia metastatica sia avviata da una singola cellula.
   nota: Le cellule tumorali tendono ad aggregarsi nella PBS entro 1-2 ore dalla tripsinizzazione e, pertanto, devono essere preparate immediatamente prima dell'iniezione. Se necessario, le cellule possono essere risospese periodicamente utilizzando la siringa da 1 mL utilizzata per le iniezioni (senza l'ago in borosilicato).
5. Se si osserva un intasamento cellulare all'interno del capillare, rimuovere il capillare, risospendere le cellule e sostituirlo con un nuovo capillare. Utilizzare lo stantuffo per espellere eventuali bolle. Se non si osservano ostruzioni cellulari o bolle, procedere al passaggio successivo.
6. Rimuovi il coperchio e trasferisci l'embrione sotto lo stereoscopio. Identificare la vena appropriata da iniettare sulla superficie del CAM. Le vene e le arterie formano l'intricata rete all'interno del tessuto CAM (Figura 1C). Le vene si distinguono per il colore rosso più brillante perché trasportano sangue ricco di ossigeno all'embrione><. nota: Per la manipolazione generale degli embrioni, l'iniezione di cellule tumorali e l'escissione di colonie metastatiche, utilizzare uno stereomicroscopio a fluorescenza dotato di obiettivi 0,8x e 1,5x e oculari 10x per la visualizzazione. Anche i microscopi meno avanzati possono essere utilizzati con successo per queste procedure, a seconda del livello di esperienza degli utenti. I lettori possono contattare gli autori per raccomandazioni più dettagliate.
7. Trova la vena ideale per iniettare le cellule che normalmente è solo leggermente più larga (10-20%) del diametro della punta dell'ago in borosilicato e situata a metà strada tra l'embrione e la parete del piatto di pesata. In genere è più facile iniettare nel punto immediatamente adiacente alla biforcazione venosa.
   nota: L'iniezione in una vena più grande può sembrare più facile, ma porterà a un sanguinamento eccessivo e a una diminuzione della sopravvivenza dell'embrione.
8. Premere la punta dell'ago contro la parete del vaso sanguigno e applicare una leggera pressione nella stessa direzione del flusso sanguigno. Se necessario, utilizzare un batuffolo di cotone (tenuto nell'altra mano) per aiutare ad ancorare o stabilizzare il vaso che viene iniettato.
9. Premere delicatamente lo stantuffo della siringa. Si può visualizzare un'iniezione riuscita osservando una "pulizia" del vaso sanguigno quando la sospensione di cellule tumorali entra nel flusso sanguigno.
10. Continuare a premere lo stantuffo della siringa per 2-10 secondi fino a quando il volume di sospensione desiderato non viene iniettato nel flusso sanguigno della vena. Complessivamente, l'iniezione di un singolo embrione può richiedere da 1 a 10 minuti a seconda del livello di esperienza dell'utente. Se nel sito di iniezione compare un sanguinamento eccessivo o un chiaro accumulo di liquido, scartare l'embrione.
    nota: È facile "sovrainiettare" un embrione. La considerazione generale che dovrebbe essere tenuta a mente è che le colonie metastatiche non dovrebbero toccarsi dopo un periodo di crescita di 4-5 giorni. Idealmente, ~5-10% dei capillari delle vene CAM terminali dovrebbero avere cellule immobilizzate al loro interno dopo un'iniezione riuscita (Figura 1D, E). Come accennato nella sezione 1, è possibile utilizzare un intervallo di concentrazione cellulare (0,5 x 10⁶ – 1,0 x 10⁶ cellule/mL). Concentrazioni più basse richiederanno un tempo di iniezione più lungo, ma ridurranno l'intasamento dell'ago. Concentrazioni più elevate richiedono tempi di iniezione più brevi, ma aumentano l'intasamento dell'ago. Si consiglia di provare diverse concentrazioni per trovare quella più comoda per un operatore. Generalmente, si preferisce una concentrazione più elevata (1,0 x 10⁶ cellule/mL) per diminuire il tempo di iniezione.
11. Rimuovere l'ago dal CAM e tamponare delicatamente il sito di iniezione con un batuffolo di cotone per rimuovere il sangue o le cellule tumorali in eccesso.
12. Coprire l'embrione nel piatto di pesata con un coperchio e rimettere l'embrione di pollo iniettato nell'incubatrice.
13. Ripetere la procedura con l'embrione successivo fino a quando tutti gli embrioni non vengono iniettati.

Figura 1: Cenni sull'iniezione di cellule tumorali e sull'isolamento delle colonie metastatiche.(A) Diagramma di flusso che delinea le fasi della piattaforma di screening degli embrioni di pollo. (B) Iniezione di cellule tumorali impostata sul tavolino del microscopio a stereofluorescenza. (C) Iniezione delle cellule tumorali nel sistema vascolare CAM. (D) Immagine che mostra l'avvenuta iniezione di cellule tumorali (densità accettabile delle cellule tumorali), scattata immediatamente dopo l'iniezione. (E) Immagine che mostra una scarsa iniezione di cellule tumorali, vista come un embrione sovra-iniettato. Notare l'accumulo di cellule tumorali nei capillari sanguigni (frecce bianche). Barre della scala = 1 cm.