Saggio di ramificazione del glicogeno per misurare il grado di ramificazione del glicogeno

1. Valutazione qualitativa della ramificazione del glicogeno

1. Preparare la soluzione satura di cloruro di calcio aggiungendo 74,5 g di cloruro di calcio anidro a ~40 ml di acqua e mescolando. Aggiungete ancora un po' d'acqua e continuate a mescolare. Portare il volume a 100 ml con acqua e continuare a mescolare fino a quando il CaCl₂ non è completamente sciolto.
2. Preparare una riserva di lavoro di reagente colorante iodio/CaCl₂ mescolando 50 μL di soluzione madre di KI/iodio con 13 mL di soluzione satura di CaCl₂ in una provetta da 15 mL. Mescolare bene e conservare a 4 °C, al riparo dalla luce. La soluzione è stabile per almeno 1 settimana in queste condizioni.
3. Determinazione della ramificazione
   1. In una provetta da 1,5 mL, combinare 650 μL di reagente colorante iodio/CaCl₂ con 100 μL di acqua e mescolare accuratamente. Trasferire la soluzione in una cuvetta monouso in metacrilato.
      nota: La soluzione nella cuvetta deve essere limpida e di colore giallo pallido.
   2. Posizionare lo spettrofotometro e, in modalità di scansione della lunghezza d'onda, raccogliere uno spettro di fondo da 330 nm a 800 nm.
   3. In una provetta da 1,5 mL, combinare 650 μL di reagente colorante iodio/CaCl₂ con 50 μg di glicogeno ostrica. Portare il volume finale a 750 μl con acqua e mescolare accuratamente. Trasferire la soluzione in una cuvetta monouso in metacrilato.
      nota: La soluzione nella cuvetta deve essere limpida e di colore arancio/marrone intenso.
4. Posizionare nello spettrofotometro e raccogliere uno spettro di assorbimento da 330 nm a 800 nm.
5. Ripetere i passaggi da 1.3.3 a 1.4 con 50 μg di amilopectina e 30 μg di amilosio.
   nota: Il campione di amilopectina deve essere giallo/verde e il campione di amilosio deve essere verde/blu. Entrambi i campioni devono essere chiari. I complessi colorati formati sono stabili, senza alcuna variazione dello spettro di assorbimento, per almeno 1 ora a temperatura ambiente.
6. Per ottenere un'indicazione della struttura ramificata di un campione di glicogeno non caratterizzato, combinare da 25 μg a 50 μg di glicogeno con 650 μl di iodio di lavoro/reagente colorante CaCl₂. Procedere come sopra, portando il volume a 750 μL con acqua, mescolando accuratamente e trasferendo in una cuvetta di metacrilato.
   nota: Il campione di glicogeno dovrebbe avere un colore da giallo/arancio ad arancione/marrone a seconda del grado di ramificazione (lunghezza delle catene esterne) del glicogeno presente. Ancora una volta, il campione dovrebbe essere chiaro.
7. Raccogli lo spettro di assorbimento.