Generazione dell'espiantazione del ganglio della radice dorsale e della coltura cellulare dissociata

1. Espiantare la coltura di DRG da un topo adulto

1. Collocare il DRG raccolto in una piastra di Petri da 35 mm contenente 3 mL di terreno ghiacciato privo di siero (SFM).
2. Trasferire ogni singolo DRG in una capsula di Petri di vetro asciutta e, sotto un microscopio operatorio, pulire e tagliare le fibre in eccesso e il tessuto connettivo ancora attaccati al DRG utilizzando una lama. Il DRG è facilmente identificabile come una struttura trasparente rigonfia lungo il nervo/radice spinale bianca. I vasi sanguigni si trovano spesso intorno al DRG.
3. Posizionare il DRG pulito in una nuova piastra di Petri contenente un terreno SFM ghiacciato.
4. Diluire la miscela proteica gelatinosa (vedi Tabella dei materiali) in SFM ghiacciato (1:1).
5. Placcare il DRG ex vivo in piastre a 12 pozzetti pre-rivestite con 10/20 μL di miscela proteica gelatinosa e posizionarle all'interno dell'incubatore a 37 °C e 5% di CO2 per 30-60 minuti.
6. Aggiungere delicatamente 1,5-2 mL di SFM al sistema di coltura per coprire l'intero espiante e mantenere gli espianti alle condizioni di coltura (37 °C e 5% di CO2).
   nota: Questo è un passaggio critico perché il DRG è ancorato alle piastre di vetro solo dalla miscela proteica gelatinosa polimerizzata. Il tempo di polimerizzazione e le competenze di pipettaggio sono fondamentali per evitare il galleggiamento.
7. Cambia il mezzo di crescita del DRG ogni 72 ore e lascia che il DRG cresca per tutto il tempo necessario.

2. Isolare i Neuroni Cellulari Singoli dal DRG

1. Collocare tutti i DRG raccolti in una provetta sterile da 1,5 mL con 1,2 mL di terreno F12 contenente 1,25 mg/mL di collagenasi EV e incubarli a 37 °C e 5% di CO2 per 45 min. Ripetere questo passaggio per altri 45 min dopo la prima incubazione.
2. Trattare gli espianti con 2 mL di terreno F12 contenente tripsina (0,025%) per 30 minuti subito dopo il trattamento con collagenasi IV a 37 °C e 5% di CO2.
3. Incubare con 2 mL di terreno F12 contenente siero fetale bovino (FBS; 33%) a 37 °C e CO2 al 5% per 15 minuti.
4. Lavare gli espianti tre volte con 2 mL di terreno F12 e procedere alla dissociazione meccanica con una pipetta di vetro fino a quando il terreno non diventa torbido.
   nota: Questa procedura prevede la raccolta di DRG puliti/rifilati dall'animale, come spiegato nella sezione precedente. Quando si esegue la dissociazione meccanica degli espianti, essere delicati e non esercitare una forza eccessiva poiché può portare a fuoriuscite e perdite di materiale di lavoro.
5. Filtrare la coltura cellulare dissociata attraverso un filtro da 0,22 μm per rimuovere eventuali impurità e tessuto connettivo in eccesso. Centrifugare il lisato cellulare filtrato a (2.500 x g) per 2 minuti.
6. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 500 μL di terreno neurobasale contenente integratore per coltura neuronale (1x), miscela antibiotica (1x), L-glutammato (0,5 mM) e fattore di crescita nervoso (5 μg/mL) (vedere la Tabella dei materiali).
7. Piastra le cellule dissociate su vetrini di copertura rivestiti di laminina (50 μg/mL; vedi Tabella dei materiali) alla densità cellulare preferita. Determinare la densità cellulare utilizzando un contatore di celle.
   nota: Abbiamo placcato le celle a 25.000 celle/vetrino di copertura. Questa tecnica consente la dissociazione sia dei neuroni che delle cellule satelliti gliali. La componente gliale co-coltivata con i neuroni pseudounipolari svolge un ruolo critico nella sopravvivenza neuronale.