Registrazione in vitro delle oscillazioni theta nell'ippocampo del topo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.                                                                                      

1. Preparazione in vitro dell'ippocampo acuto

NOTA: L'isolamento della preparazione ippocampale intatta comporta tre passaggi principali: (1) Preparazione di soluzioni e apparecchiature, (2) Dissezione dell'ippocampo e (3) Impostazione del sistema di velocità di perfusione veloce necessario per la generazione di oscillazioni theta intrinseche. In questo protocollo, l'esecuzione tempestiva delle procedure – dalla dissezione alla registrazione – è particolarmente importante perché l'ippocampo isolato costituisce una preparazione così densa ma delicata che il mantenimento della connettività funzionale della struttura in vitro richiede grande cura. Preparare tutto in anticipo garantisce che sia disponibile un livello adeguato di perfusione il prima possibile per ridurre al minimo il danno cellulare e mantenere la funzione fisiologica.

1. Soluzione artificiale di liquido cerebrospinale (aCSF) a base di saccarosio
   1. Preparare la soluzione stock di saccarosio 1X da utilizzare per la dissezione e l'incubazione post-dissezione. Combinare tutti i componenti elencati nella Tabella 1, ad eccezione del CaCl₂, in 1 L di acqua deionizzata e conservare a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
2. Soluzione aCSF standard
   1. Preparare l'aCSF standard per la perfusione ad alta velocità di flusso dell'ippocampo isolato durante le registrazioni elettrofisiologiche. Per ottenere l'aCSF madre concentrato (5X), sciogliere tutti i componenti elencati nella Tabella 2, ad eccezione del CaCl₂, in 2 L di acqua deionizzata e conservare a 4 °C.
3. Preparare l'attrezzatura
   1. Prima di iniziare la dissezione, allestire l'area del banco con una vaschetta di plastica riempita di ghiaccio (30 x 20 x 5 cm), tubi collegati al carbogen e tre piastre di Petri in vetro (10 x 2 cm) (vedere la Figura 1).
   2. Aggiungere 300 mL di soluzione di saccarosio (1X stock) a un becher da 500 mL, bollirlo con carbogeno (95% O₂, 5% CO₂) e aggiungere Ca₂+ [1,2 mM].
   3. Trasferire 60 mL di questa soluzione di saccarosio in una capsula di Petri di vetro e lasciare a temperatura ambiente. Mettere il resto in congelatore a 4 °C per 10 - 15 minuti.
   4. Far bollire la soluzione di saccarosio ghiacciata con carbogno durante la dissezione.
   5. Riempire una seconda capsula di Petri (camera di contenimento fredda) con una soluzione di saccarosio (4 °C) e tenerla in ghiaccio.
   6. Aggiungere 30 ml di soluzione di saccarosio ghiacciata a un becher da 50 ml.

2. Dissezione dell'intero ippocampo

NOTA: Il metodo per sezionare l'ippocampo isolato è essenzialmente identico a quello sviluppato e descritto originariamente, ma con ulteriori dettagli e modifiche riguardanti il tasso di perfusione e le tecniche di registrazione.

1. Dissezione cerebrale
   1. Anestetizzare il topo sotto una cappa aspirante con un piccolo tovagliolo di carta imbevuto di 1 mL di isoflurano (100%) che viene aggiunto nella gabbia.
   2. Decapitare il topo anestetizzato e immergere rapidamente la testa in una soluzione di saccarosio ghiacciata (becher da 50 ml, ~ 5 s). Trasferire su carta assorbente.
   3. Usa un bisturi per praticare un'incisione cutanea mediale (da caudale a rostrale) e spingi la pelle sui lati per esporre il cranio.
   4. Taglia il cranio con una piccola forbice e usa una spatola per estrarre rapidamente il cervello e lasciarlo cadere nella capsula di Petri contenente una soluzione di saccarosio ghiacciata. Lasciare raffreddare 1-2 minuti per il cervello.
   5. Mentre il cervello si sta riprendendo, aggiungere 2 - 3 ml di soluzione di saccarosio su una capsula di Petri (dissezione) ricoperta di carta per lenti su ghiaccio.
2. Isolare l'ippocampo
   1. Posizionare il cervello sul piatto di dissezione in posizione verticale.
   2. Rimuovere il cervelletto e la corteccia frontale con una lama di rasoio. Tagliare il cervello a metà lungo il piano sagittale medio e riportare i due emisferi isolati nella camera di contenimento. Attendere altri 1 - 2 minuti per il recupero.
   3. Posizionare un singolo cervello emiseccitato in posizione verticale sul piatto di dissezione.
   4. Ruotare il piatto fino a quando le strutture sagittali medie sono rivolte verso l'osservatore e il contorno incorporato del complesso settale è visibile come un sottile strato di tessuto a forma di pera anteriore al talamo.
   5. Tenere fermo il cervello emiseccitato con la micro spatola e posizionare l'estremità piccola della spatola rivestita di politetrafluoroetilene (PTFE) immediatamente dietro (caudalmente alla) l'area del setto.
   6. Inserire la spatola rivestita sotto il setto e spostare la punta verso il basso fino a raggiungere la capsula di dissezione. Recidere caudalmente le fibre che collegano l'area del setto. Ripetere la stessa operazione lungo il bordo anteriore del setto e tagliare le fibre che si collegano alla parte frontale del cervello.
   7. Con la spatola che tiene leggermente la parte interna della corteccia appena sopra l'ippocampo in posizione verticale, usa la micro spatola per tirare con cautela verso il basso i nuclei talamo, ipotalamico e il tronco encefalico rimanente. Quindi, usa la spatola per tagliare e rimuovere il fazzoletto staccato.
   8. Gira l'emisfero isolato su un lato e identifica il contorno dell'ippocampo.
   9. Inserire la spatola rivestita nel ventricolo laterale sotto l'estremità rostrale dell'ippocampo dorsale.
   10. Tenere la spatola allineata orizzontalmente con il piano sagittale medio del cervello emisettico e farla scorrere attraverso il contorno liscio delle pareti ventricolari fino a quando la punta non emerge caudalmente.
   11. Tenere la spatola sotto l'ippocampo e premerla leggermente sulle fibre di collegamento lungo lo strato interno dove l'ippocampo si unisce alla corteccia sovrastante. Applicare la micro spatola sul lato esterno di questo strato e farla scorrere contro la spatola rivestita per tagliare le fibre di collegamento.
   12. Per completare l'estrazione, ruotare la capsula di dissezione e inserire la spatola rivestita sotto l'ippocampo ventrale. Tenere leggermente l'interno della piega corticale con la spatola e tagliare le connessioni entorinali con un movimento a fette contro la micro spatola><. nota: L'intero complesso setteippocampale può essere rimosso posizionando la spatola rivestita sotto l'intero ippocampo ed estraendo il tessuto cerebrale rimanente al di sotto.
   13. Una volta completato l'isolamento, tieni l'ippocampo appoggiato sul piatto e aggiungi una goccia di soluzione di saccarosio ghiacciata per mantenerlo fresco. Taglia con cura la corteccia e le fibre rimanenti e separa l'ippocampo dal setto applicando delicatamente una lama di rasoio attraverso il fornice.
       nota: Se le registrazioni con patch clamp devono essere eseguite da celle piramidali, l'ippocampo isolato può essere tagliato trasversalmente con un angolo di 45° per esporre lo strato piramidale di Cornu Ammonis (CA)1 (preparazione "angle-cut") senza compromettere i circuiti della rete locale nella porzione rimanente dell'ippocampo.
   14. Trasferire il preparato in una soluzione di saccarosio a temperatura ambiente e lasciarlo riposare per 15 - 30 minuti prima di trasferirlo nella camera di registrazione.

3. Imposta la Perfusione Veloce per Registrare l'Ippocampo Isolato

1. Impostare il sistema di perfusione alimentato per gravità per consentire l'afflusso continuo ad alta velocità di aCSF ossigenato a 20 - 25 mL/min.
   1. Preparare in anticipo fiasche di CSF (1X) e immergerle in un bagno riscaldante (~30 °C) almeno 15 minuti prima dell'inizio dell'esperimento. Accendere il sistema di riscaldamento della soluzione in linea (30 °C).
   2. Utilizzare gorgogliatori per acquari e tubi collegati a un serbatoio di carbogeno per ossigenare l'aCSF durante l'esperimento e aggiungere CaCl₂ [2 mM] prima dell'inizio della perfusione.
   3. Arrestare il flusso di aCSF e trasferire l'ippocampo nella camera di registrazione utilizzando l'estremità larga di una pipetta di vetro. Lasciare che il preparato saturo di saccarosio affondi e si depositi sul fondo.
   4. Posizionare il preparato al centro della camera di registrazione (in linea con l'asse di ingresso-uscita) con la superficie liscia di CA1 e SUB sulla parte superiore.
   5. Stabilizzare l'ippocampo con piccoli pesi alle estremità settali e temporali e riavviare il flusso di aCSF.

4. Elettrofisiologia nell'ippocampo isolato

1. Registrazione extracellulare delle oscillazioni theta dell'ippocampo in vitro
   1. Per il monitoraggio extracellulare del potenziale di campo locale (LFP) o dell'attività di una singola unità dall'ippocampo isolato in vitro, utilizzare micropipette di vetro (1 - 3 MΩ) riempite con aCSF. Registra segnali di potenziale di campo accoppiati in CA a basso rumore con un amplificatore patch clamp con guadagno x1000, filtraggio passa-banda online 0,1 - 500 Hz e una frequenza di campionamento di 5-20 kHz.
      nota: Il microscopio personalizzato utilizzato in questo protocollo è dotato di obiettivi a basso (2,5X) e ad alto ingrandimento (40X) per una visione a basso ingrandimento dell'ippocampo, nonché di microscopia video a infrarossi ed epifluorescenza per il riconoscimento di singole cellule. I componenti di questo sistema includono il microscopio a fluorescenza verticale, i cubi con filtro a fluorescenza, una videocamera analogica e un frame grabber digitale con software di imaging, una camera di perfusione personalizzata sul tavolino (Figura 2A, riquadro i) e micromanipolatori ad alta precisione per le registrazioni neuronali e il posizionamento delle fibre ottiche.
   2. Utilizzare la telecamera montata sul microscopio e collegata al display di un computer per ispezionare la preparazione ippocampale a basso ingrandimento (2,5X) e verificare rapidamente che non vi siano sottosquadri o danni alla superficie esterna. La disposizione diagonalmente orientata delle fibre alveologiche lungo la superficie liscia di CA1 dovrebbe essere visibile (Figura 2A, riquadro ii) quando la luce trasmessa attraverso l'ippocampo.
   3. Utilizzare l'obiettivo a campo largo a basso ingrandimento per visualizzare l'ippocampo isolato e il posizionamento degli elettrodi LFP in posizioni di registrazione specifiche.
      nota: Nella Figura 2A è illustrato uno schema della preparazione ippocampale isolata con più elettrodi posizionati in diverse posizioni di registrazione.
   4. Abbassare un elettrodo LFP nel bagno fino a toccare la superficie (alveo) dell'area CA1.
      nota: Questo di solito produce un transitorio veloce nella registrazione accoppiata in CA, simile a ciò che accade quando l'elettrodo entra in contatto con il supporto di registrazione. Un monitor audio può essere utile per ascoltare il segnale del canale LFP dopo questo passaggio.
      nota: Spesso, i primi segni di attività compaiono solo dopo 10-15 minuti, quindi è importante non avanzare rapidamente nella preparazione. Se dopo questo periodo, l'elettrodo LFP di superficie non rileva ancora attività, avanzare un po' più in basso attraverso lo strato oriens e fermarsi periodicamente per vedere se si verifica una qualche forma di attività mentre ci si avvicina allo strato cellulare principale. Se non viene rilevato nulla dopo altri 5 - 10 minuti, ritrarre con cautela l'elettrodo e posizionarlo altrove lungo la stessa regione.
   5. Far avanzare l'elettrodo LFP attraverso lo strato piramidale. Si osservi che l'attività di spiking extracellulare aumenta inizialmente quando viene rilevata la scarica di una singola unità dai singoli neuroni (per lo più cellule piramidali e inibitorie). Abbassare ulteriormente l'elettrodo e notare che lo spiking inizia a svanire di nuovo quando la punta attraversa il radio. Si osservi che un'oscillazione di rete chiaramente visibile nell'intervallo di frequenza theta (4 - 12 Hz) diventa evidente e raggiunge l'ampiezza massima (~100 - 300 μV) man mano che la posizione di registrazione viene abbassata attraverso il raggio.
2. Oscillazioni theta in una singola regione
   1. Per testare le proprietà spaziali delle oscillazioni spontanee theta attraverso la regione CA1, posizionare la punta di un elettrodo LFP di riferimento in un sito CA1 mediale (situato medialmente lungo l'asse longitudinale setto-temporale) e abbassarlo nel raggio come descritto in precedenza.
   2. Posizionare un secondo elettrodo LFP in un sito CA1 (200 - 800 μm settale o temporale dal primo LFP) e osservare che le oscillazioni theta CA1 possono sincronizzarsi su distanze relativamente grandi.
3. Oscillazioni theta tra gli strati
   1. Per testare le proprietà delle oscillazioni theta attraverso gli strati dell'ippocampo, lasciare un elettrodo LFP di riferimento in un sito di radio CA1. Partendo da appena sopra lo strato oriens, si abbassa un secondo elettrodo nello strato di cella piramidale e attraverso il radiato. Osservare una graduale inversione del segnale LFP (inversione di fase relativa) attraverso lo strato piramidale.
      nota: Per esempi rappresentativi di questi tipi di attività, vedere la Figura 2B. Esempi di profili laminari/di profondità e analisi della densità della sorgente di corrente (CSD) che illustrano il sito di inversione di fase nell'ippocampo isolato sono stati pubblicati in precedenza.

Tabella 1.

Tabella 2.

Figura 1: Procedura di dissezione per la preparazione isolata dell'ippocampo intatto.

(a) Vista generale della configurazione della dissezione. In alto a destra: pallone di soluzione di saccarosio ghiacciato carbogenato (1); in basso a sinistra: vaschetta di plastica riempita di ghiaccio (2) che contiene la vaschetta di dissezione coperta con carta per lenti (3); la camera di contenimento fredda contenente la soluzione di saccarosio (4); e un set di strumenti chirurgici (5). (b) Vista del cervello del topo prima dell'emisezione sul piatto di dissezione. (c) Recupero del cervello emisettato nella camera di permanenza fredda e vista ingrandita (riquadro) dell'emisfero cerebrale sinistro prima di inserire l'estremità piccola della spatola rivestita sotto il setto. (d) Una spatola rivestita posta sotto l'ippocampo isolato, lungo la regione CA1/SUB, con il tessuto cerebrale rimanente viene estratta da sotto.

Figura 2: Configurazione della configurazione per la registrazione in vitro delle oscillazioni theta dalla preparazione dell'ippocampo intatto nella camera di registrazione sommersa.

(a) L'ippocampo isolato è mostrato con una disposizione delle regioni dell'ippocampo e più elettrodi posizionati in quattro diversi siti di registrazione distribuiti settotemporalmente (indicati da asterischi bianchi). Nella vista della piattaforma della camera di registrazione mostrata sopra (riquadro i), l'ingresso e l'uscita per il flusso di perfusione veloce sono indicati da numeri (1, 2). Nell'immagine ingrandita dell'ippocampo mostrata di seguito (riquadro ii), un singolo elettrodo è posizionato nel CA1 medio-settotemporale e le fibre dell'alveo sono facilmente visibili, correndo diagonalmente verso il subiculum. S: settale, T: temporale, f/fx: fimbria-fornice. (b) Rappresentazione schematica dell'organizzazione degli strati di CA1 con tracce rappresentative di LFP registrate simultaneamente dallo strato oriens (grigio) e dallo strato radiatum (nero). Si noti la fase invertita dei segnali tra i due strati. Alv: strato alveo, PR: strato piramidale, SR: strato radiatum. SLM: strato lacunosum molecolare. (c) Esempio di traccia LFP che mostra l'oscillazione theta spontanea registrata dall'area CA1/SUB (segmento di 20 secondi) e dai segmenti espansi di 2 secondi (sotto) dal segnale non filtrato; passa-banda filtrato per frequenze theta (0,5 - 12 Hz); gamma lenta (25 - 55 Hz); e gamma veloce (125 - 250 Hz).