Induzione di lesioni cerebrali traumatiche penetranti nelle mosche adulte di Drosophila

1. Lesione cerebrale traumatica penetrante (PTBI; Figura 1)

1. Ordina le mosche F1 appena chiuse. Selezionare i giovani maschi entro 6 ore dalla clossione. Mettere questi maschi in fiale pulite contenenti cibo, con 40 mosche o meno per fiala.
   NOTA: Questo è più facilmente realizzabile a metà mattina anestetizzando le mosche sul cuscinetto CO₂ e identificando i maschi adulti che hanno ancora meconio (visibile come una macchia verdastra scura attraverso la parete addominale) nelle loro viscere.
2. Igienizzare i perni Minutien (vedi Tabella dei materiali) per almeno 5 minuti inserendo ~100 spilli in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml riempita con etanolo al 70%.
3. Igienizzare il tampone CO₂ e un pennello spruzzando etanolo al 70% e asciugare con un fazzoletto pulito e privo di lanugine. Una volta che gli strumenti sono puliti e asciutti, trasferire 40 o meno maschi F1 ordinati sul tampone pulito.
4. Separa i maschi F1 in 2 gruppi sul fly pad. Un gruppo servirà come controllo, mosche illese. Il secondo gruppo sperimentale sarà sottoposto a PTBI.
5. Usando una pinza, estrarre 4-5 nuovi perni Minutien dalla provetta della microcentrifuga e posizionarli vicino al bordo del tampone CO₂. Sotto il cannocchiale da dissezione, scegli uno spillo Minutien dritto con una punta acuminata.
   NOTA: L'uso di un singolo pin Minutien per un esperimento ridurrà la variabilità. Riutilizza i perni affilati. Posizionare i perni danneggiati o smussati in una provetta per microcentrifuga separata da 1,5 ml contenente il 70% di etanolo per uno smaltimento sicuro.
6. Se si lavora con mosche della croce standard, accendere la lampada a diodo a emissione di luce (LED) per stereomicroscopio dotata di filtri di eccitazione ed emissione appropriati per la proteina a fluorescenza verde (GFP). Ciò consente l'eccitazione a 440-460 nM e consente la visualizzazione di 500-560 nM.
   NOTA: Con questo set di lampade e filtri, i corpi cellulari del corpo del fungo emetteranno fluorescenza verde attraverso la cuticola della testa (Figura 1C). Per le mosche gemelle permanenti o per le mosche di altri genotipi, un illuminatore a luce bianca standard per lo stereomicroscopio può essere utilizzato per visualizzare i punti di riferimento sulla cuticola della testa per mirare alla lesione al corpo del fungo (Figura 1C).
7. Usa la pinza per raccogliere e tenere il perno Minutien selezionato in una mano (per i destrimani, di solito è la mano destra) e il pennello nell'altra mano (di solito sinistra). Scegli una mosca dal gruppo sperimentale e posiziona la mosca in modo da avere una vista dorsale della capsula della testa con la testa della mosca a destra. Posiziona la spazzola sulla parte anteriore del torace dorsale e spingi delicatamente verso il basso per stabilizzare la mosca.
8. Punta la punta dello spillo Minutien sui corpi cellulari del corpo del fungo sul lato destro della testa e penetra nella capsula della testa. Se si utilizzano punti di riferimento, puntare alla cuticola della testa dorsale tra gli ocelli e il bordo dorsale dell'occhio (Figura 1).
9. Dopo aver completato l'infortunio, usa il pennello per spingere delicatamente la testa fuori dal perno Minutien.
10. Se si utilizza il cervello per RNA-Seq o qRT-PCR, fare una seconda lesione sul lato sinistro della testa.
11. Ripetere i passaggi 2.8-2.10 per ferire tutte le mosche del gruppo sperimentale.
12. Una volta che tutte le mosche sono state ferite, posizionare le mosche di controllo e quelle ferite in fiale etichettate e separate contenenti cibo. Appoggiare le fiale orizzontalmente (cioè su un lato) mentre le mosche si riprendono dall'anestesia e durante il successivo invecchiamento per evitare che le mosche rimangano impigliate nel cibo.
13. Posizionare le mosche incrociate standard a 25 °C e le mosche gemelle permanenti a 30 °C per invecchiare.
14. Per le mosche di età superiore alle 24 ore, posizionarle su cibo pulito ogni 1-2 giorni.

Figura 1: Lesione cerebrale traumatica penetrante (PTBI) al cervello centrale della Drosophila adulta. (A) Schema dell'esterno di una testa di mosca adulta. Questa è una vista frontale. Pertanto, il lato destro dell'animale è alla sinistra dello spettatore. (B) Schema dell'interno della testa di una Drosophila adulta con la traiettoria della lesione indicata in grigio. Questa è una vista posteriore. Così, in questa immagine e nelle figure successive, il lato destro del cervello è a destra. La PTBI cerebrale centrale colpisce più strutture cerebrali, tra cui il corpo del fungo (verde) e i tessuti al di fuori del cervello, tra cui il corpo grasso (blu) e gli emociti (rosso). CB = regione centrale del cervello. OL= regione del lobo ottico. (C) Vista dorsale di una testa adulta viva in cui i corpi dei funghi (punte di freccia) sono marcati con una proteina fluorescente verde (GFP). Questo è il "genotipo standard" (vedi il testo per i dettagli). Il protocollo PTBI provoca in modo riproducibile lesioni ai corpi dei funghi.