Ex vivo Cultura della Drosophila pupa testicolo e singolo maschio cisti germinale: Dissezione, Imaging, e trattamento farmacologico

Lo sviluppo delle cellule germinali maschili di molte specie è un processo sequenziale. Essa è caratterizzata da una serie di eventi cruciali che culmina nella formazione di spermatozoi morfologicamente e epigeneticamente altamente specializzato. In Drosophila melanogaster, le cellule staminali della linea germinale sulla punta della divisione testicolo asimmetricamente per dare origine ad una nuova cellula staminale e la spermatogonio, vale a dire, la cellula figlia che si impegna per la differenziazione (vedi Figura 1 per una panoramica) ^1,2 . Il spermatogonio subisce quattro turni di divisioni mitotiche e, con l'inizio della meiosi, una fase di notevole crescita e l'attività trascrizionale chiamato la fase spermatocita. Le cellule provenienti da un spermatogonio rimangono collegati tra loro e si sviluppano come un fascio sincronizzato avvolto da due cellule somatiche-una struttura denominata una cisti. Dopo il completamento della meiosi, la morfologia delle cellule germinali maschili è completamenteriorganizzati (schematicamente illustrato in figura 1). Inizialmente, spermatidi rotondi allungano per formare la struttura testa idrodinamico, e il flagello sviluppa. Infine, le cellule spermatiche sono separate l'una dall'altra da un complesso meccanismo di apoptosi connesse chiamato individualizzazione ^{3 - 5.}

In molte specie, tra cui Drosophila melanogaster e specie di mammiferi, i cambiamenti morfologici delle cellule germinali sono accompagnati da una notevole riarrangiamento epigenetico del aploide maschile germinale cromatina, chiamato interruttore istone-a-protamina (switch HP) ^6-9. Forse quasi tutti istone canonico e molte molecole di istone-variante vengono rimossi dalla DNA e sono sostituiti da piccole proteine ​​di base, le protamine, con conseguente struttura nucleoprotamine estremamente compatto specifico per la cromatina degli spermatozoi maturi. Caratteristiche generali dello switch HP sono tegli sostituzione degli istoni canonici prima da varianti istoniche, poi da proteine ​​di transizione, e infine da protamine. Il tutto è accompagnato da diverse modifiche segnali epigenetici, come ad esempio un aumento dei livelli di acetilazione dell'istone H4 appena prima della rimozione istone ^{7,10 - 12.}

La maggior parte, se non tutti, dei processi sopra menzionati sono essenziali per lo sviluppo di una matura, sperma interamente fertili. Questo è vero non solo in Drosophila, ma anche negli esseri umani, come le azioni spermatogenesi mammiferi una notevole quantità di somiglianza con il ^1,8,9 sistema di invertebrati. Studiare lo sviluppo cellula germinale maschile è molto facilitato nel sistema modello Drosophila. Le mosche sono geneticamente altamente accessibile. La generazione di mutanti, nonché la creazione di ceppi mosca esprimere geni di fusione o costrutti di interferenza RNA richiede poco sforzo. Tuttavia, nello studio di spermatogenesi post-meiotica, l'uso di mutanti und semplici strumenti genetici potrebbero raggiungere un limite. In Drosophila spermatogenesi, trascrizione cessa quasi completamente con l'entrata in divisioni meiotica. Così, la spermatogenesi post-meiotico si basa principalmente su mRNA traslazione repressi e memorizzati sintetizzati in una profase meiotica esteso ^{13 - 16.} Pertanto, strumenti come RNA interference o l'uso di mutanti non condizionali non sono adatti per studiare specificatamente i ruoli post-meiotici di prodotti genici che soddisfano anche funzioni essenziali per lo sviluppo delle cellule germinali pre-meiotica o meiosi.

Un vantaggio di Drosophila che può essere sfruttato in questi casi è la capacità di testicoli intatti sezionati e anche cisti di cellule germinali di sviluppare ex vivo di cultura medio ^{4,12,17 - 20.} La dissezione e la coltivazione dei testicoli o cisti germinali permette non solo l'osservazione microscopica di sviluppo germinale delle cellule in cellule viventi, ma unaLSO l'uso di dosaggi farmacologici con, ad esempio, gli inibitori dei complessi enzimatici, come istone acetiltransferasi (copricapo), istone deacetilasi (HDAC), topoisomerasi, o il proteasoma. Quindi, è possibile manipolare le funzioni enzimatiche durante la spermatogenesi post-meiotico e per monitorare i risultati di sviluppo a prescindere embrionali, pre-meiotica o meiosi funzioni ^4,12.

In saggi farmacologici, abbiamo già analizzato la localizzazione acetilazione-dipendente di una proteina bromodomain durante la profase meiotica, nonché la rilevanza dei livelli di acetilazione degli istoni per lo switch HP epigenetico nella spermatogenesi post-meiotico utilizzando inibitori specifici di targeting cappelli e HDAC ^12,21. Targeting l'interruttore HP in questi test è stato reso possibile utilizzando un ceppo mosca che esprime i geni di fusione histone2AvD-RFP e protamineB-eGFP ^12,22 nei modelli endogeni, e l'osservazione chei primi spermatidi in testicoli pupa passano attraverso lo switch HP tra 24 e 48 ore APF ^12.

Il protocollo presentato descrive la dissezione dei testicoli e cisti di Drosophila pupe, le condizioni di coltura, e un test farmacologico con testicoli pupa intatti. A questo scopo, testicoli pupa a circa 24 ore dopo la formazione puparium (APF) sono sezionati (vedi figure 1 e 2). In questo momento, i testicoli non hanno collegamenti con altri tessuti e sono circondato solo da una guaina esterna sottile, che permette una migliore penetrazione dei composti inibitori ^23,24. I testicoli sono organi bean- oa forma di pera che possono essere facilmente presi in cultura. I testicoli sono sezionati, colta, e trattati con inibitori specifici. Successivamente, gli effetti degli inibitori sono monitorati con analisi di immunofluorescenza e microscopia a fluorescenza di espressione della proteina di fusione, e confrontando la Morphol nuclearelogia delle cellule germinali trattate a quella delle cellule germinali non trattate. Le condizioni presentate in questo protocollo permette anche l'imaging dal vivo di sviluppare testicoli e cisti della linea germinale in cultura.

Etica dichiarazione:
Le procedure sperimentali descritte in questo protocollo si riferiscono a lavori esclusivamente con Drosophila melanogaster e non sono soggetti alle leggi sul benessere degli animali in Germania.

1 Preparazione di media, strumenti, e Flies

1. Preparare modificato disponibile in commercio in polvere mezzo di crescita di M3 senza bicarbonato di potassio ^17. ATTENZIONE: Irritante per gli occhi e la pelle. Supplemento del mezzo con siero fetale bovino al 10%, 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina. Utilizzare siero testato insetto-cultura-inattivato al calore e fetale bovino per i migliori risultati. Filtrare il terreno completo (di seguito come mezzo) con un 0,2 micron unità filtrante per bottiglia e conservare in aliquote a -20 ° C. Prima dell'uso, il filtro (0,2 micron punta filtro siringa) il mezzo di nuovo per rimuovere precipitati.
2. Preparare soluzioni inibitore azionari per i saggi farmacologici. Dissolve le sostanze chimiche nel solvente e conservare adeguata in aliquote. Ad esempio, preparare una soluzione madre di 28.69 mM acido anacardic (ATTENZIONE: Irritante per gli occhi e la pelle) in dimetilsolfossido.
3. Preparare gli strumenti per l'interruzione dei testicoli pupa sezionati e dissezione dei singoli cisti. Usare due aghi appuntiti e rigidi, piuttosto che un paio di pinze. La forza capillare che si sviluppa tra i due rami di un paio di pinze rende la dissezione dei singoli cisti in piccole quantità di mezzo molto difficile. Ad esempio, utilizzare la punta di uno spillo insetto acciaio inox inserita in un supporto ad anello inoculazione.
4. Al fine di ottenere pupe opportunamente invecchiato, semi di circa 10 grandi flaconi di coltura (tubi con diametro 4 cm), con un numero sufficiente di mosche adulte (circa 40-60 mosche). Per analizzare l'interruttore HP, utilizzare le mosche che esprimono H2AvD-RFP e ProtamineB-eGFP nel loro modello endogeno ^12,16,22. Incubare le fiale in condizioni standard a 25; ° C per circa 4-5 giorni fino terze larve instar strisciare su e iniziare a impupamento sulle pareti dei flaconcini ^25.

2 Marcatura o Raccolta Bianco Pre-pupe ottenere 24-hr-old Pupae per dissezione

1. Per verificare l'influenza di alcune sostanze chimiche sullo switch HP, sezionare testicoli pupa a circa 24 ore APF ^12. Per ottenere pupe in scena, prendere i flaconi di coltura fly preparati con pupating larve (vedere paragrafo 1.4) e identificare il maggior numero bianco pre-pupe possibile. Pre-pupe durante il primo passo in impupamento appaiono come immobile, non l'alimentazione, larve piuttosto accorciato con spiracoli estroflessi e puparium di colore bianco. Il puparium diventa tan-marrone all'interno di 30 a 60 minuti, che indica la prossima fase di sviluppo pupa ^26.
2. Segnare le posizioni del pre-pupe con un pennarello indelebile sulla parte esterna delle fiale. Incubare le fiale a 25 ° C per circa 24 ore.
   1. Alternativamente,accompagnamento pre-pupe dal lato delle fiale con un pennellino inumidito con tampone PBS. Poi il trasferimento pre-pupe al lato di un tubo di reazione 50 ml fresco e incubare a 25 ° C per circa 24 ore.

3. dissezione di pupa testicoli a circa 24 ore dopo puparium Formazione

1. Distribuire alcune gocce (circa 80 ml ​​ciascuna) di media su un 10 centimetri di coltura cellulare di plastica o una scatola Petri. Utilizzando una vasta paio di pinze o un pennello inumidito con il mezzo, prendere le pupe in fase di APF 24 ore dai flaconcini incubate (vedere paragrafo 2). Trasferire una pupa ad ogni goccia di terreno sul piatto.
2. Per la dissezione, utilizzare uno stereo-microscopio equipaggiato con un illuminatore a fibre ottiche. Non riscaldare i testicoli sopra RT durante la dissezione in quanto ciò potrebbe impedire un corretto sviluppo della cultura.
   1. Sezionare pupe con due coppie di n ° 5 pinze. Con una coppia, afferrare la pupa al suo più posterioreparte (i spiracoli posteriori) e tenerlo in posizione.
   2. Prendete le spiracoli anteriori con l'altra coppia di pinze e aprire l'opercolo pupa alla sua estremità anteriore. Staccare il caso pupa fino a quando almeno una parte del torace è esposto.
   3. Continuare a tenere la pupa in posizione per la sua fine più posteriore. Per rilasciare la pressione interna della pupa, inserire entrambe le braccia di un paio di pinze nella regione della testa della pupa.
   4. Strappare la pupa aperta aprendo la pinza e muovendo la pinza nella direzione anteriore. Assicurarsi che l'apertura generata con questo movimento è il più grande possibile nel primo tentativo. Evitare di danneggiare la pupa alla sua estremità posteriore, prima che la pressione è stata rilasciata in quanto ciò potrebbe comportare testicoli spinti direttamente attraverso la piccola apertura e più spesso di essere interrotti.
   5. Si osservi che una volta che la pupa è aperto, la pressione interna liberato della pupa preme fuori agglomerati di cellule di grasso e tessuto attraverso il laapertura rge nella regione della testa. Controllare se i testicoli pupe sono già stati spinti fuori dalla pupa con questo materiale; ciò si verifica in alcuni casi. I testicoli non sono collegati a qualsiasi altro tessuto a 24 ore APF e, pertanto, potrebbero essere espulsi facilmente dalla pupa ^23.
   6. Evitare di schiacciare la pupa con le pinze in quanto questo potrebbe danneggiare i testicoli se rimangono in pupa. Aumentare la dimensione dell'apertura utilizzando un paio di pinze.
   7. Quindi tenere la pupa alla sua estremità più posteriore. Chiudere l'altra coppia di pinze e delicatamente striscia fuori il contenuto della pupa da posteriore a anteriore a rilasciare i testicoli dalla pupa.
3. Raccogliere i testicoli tirandoli in una punta di pipetta 200 microlitri pre-tagliati. Provate a trasferire solo una piccola quantità di mezzo per ridurre il numero delle cellule del corpo grasso trasferiti con i testicoli. Posizionare i testicoli in media in un piatto di coltura fresco. Lavare i testicoli più volte con mezzo fino a che solo poche cellule di grasso corporeos rimangono.
4. Per l'imaging dal vivo, trasferire testicoli a un piatto di cultura con fondo di vetro con i media e utilizzare un microscopio invertito di imaging. Per i saggi farmacologici, continuare con il passaggio 5.

4 dissezione Maschile cisti Germ-line e dal vivo Imaging

1. Trasferire uno o più testicolo pupa ad un piatto di cultura con fondo di vetro.
2. Utilizzare un impianto stereo-microscopio con illuminazione a fibre ottiche e due aghi di acciaio inossidabile (vedi sezione 1.3) per la dissezione dei maschi cisti germinali.
   1. Con un ago, cercare con attenzione da definire un testicolo al suo anteriore o estremità posteriore. Tenerlo in posizione. Inserire l'altro ago nel testicolo e disturbare la guaina testicolo spostando l'ago lateralmente. Molte delle cisti sarà rilasciato dal testicolo da questo movimento.
   2. Continuare a tenere il testicolo in posizione con un ago. Striscia delicatamente i restanti cisti del testicolo con l'altro ago.
   3. Cisti aggregati separati sia da gently lo spostamento di un ago lateralmente attraverso il cluster di cisti o trasferendo le cisti ad un piatto di coltura fresco con supporto utilizzando un puntale 200 microlitri.
3. Spostare il piatto cultura di un microscopio invertito di imaging per l'imaging dal vivo di singole cisti. Disperse nuovamente cisti con un ago, se necessario.
   1. Identificare la fase delle cisti mediante contrasto di fase e microscopia a fluorescenza.
   2. Concentrarsi su una cisti del palco desiderato. Confermare la messa a fuoco e la posizione della cisti frequentemente durante gli esperimenti di imaging più lunghi, come le cisti non aderiscono al fondo del piatto cultura e quindi tendono a galleggiare fuori fuoco.
      NOTA: Rivestimento il piatto con poli-L-lisina per immobilizzazione è dannosa per lo sviluppo dei primi cisti germinali. Al contrario, le singole cisti possono essere isolati. Con una certa pratica, è possibile individuare una particolare cisti spingendo molto delicatamente con l'ago. Ciò consentirà il trasferimento di singole cisti al culto separatopiatti ure con una pipetta Pasteur di vetro con una punta protratta che si inserisce nel campo visivo del microscopio. Le cisti isolate quindi possono essere facilmente trasferiti nelle piastre di coltura anche dopo incubazione a lungo termine.

5. farmacologica Assay con Intact pupa Testicoli

1. Riempire ciascun pozzetto di una piastra di coltura cellulare di 24 pozzetti con 500 ml di mezzo per un esperimento di 12 repliche. Trasferimento di una pupa testicolo in ogni pozzetto, usando un puntale 200 microlitri pre-tagliati.
   1. Verificare la presenza di protamine nei testicoli isolate utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito. I testicoli dovrebbero essere liberi di segnale ProtamineB-eGFP, che indica che l'interruttore HP non ha avuto luogo in una delle cisti. Sostituire testicoli che mostrano già cisti ProtamineB-eGFP-positivi.
   2. Per i primi 12 pozzetti, aggiungere 500 ml di terreno contenente composto inibitore diluito (acido anacardic) per raggiungere la concentrazione finale desiderata(150 mM) in 1 ml di terreno per pozzetto. Utilizzare i restanti pozzi come controlli non trattati; aggiungere 500 ml di terreno con la stessa quantità di solvente utilizzato come con i composti inibitori. Nota: Se si utilizzano molti composti e solventi diversi, potrebbe essere più efficace utilizzare solo come mezzo di controllo e di testare l'influenza di concentrazioni crescenti di solventi in esperimenti separati.
2. Incubare la piastra a 25 ° C per 24 ore al buio.
3. Verificare nuovamente la presenza di protamine nei testicoli incubati come descritto sopra. I testicoli di controllo dovrebbero ora mostrare cisti uno o più ProtamineB-eGFP-positivi, che indica il passaggio attraverso lo switch HP.
4. Usando una pipetta con una punta di 200 microlitri, trasferire i testicoli per vetrini poli-L-lisina rivestite, fare i preparativi da squash e macchia con anticorpi fluorescenti appropriate come descritto altrove ^12,27,28.

Il testicolo nei maschi di Drosophila è già formato nell'embrione e persiste nella cavità del corpo durante le fasi larvali. Terzo-instar larve mostrano piccoli, testicoli rotonda circondata da uno strato di cellule pigmentate futuri e integrati nel tessuto grasso corporeo (Figura 2A). Testicoli di mosche maschi adulti sono lunghi, tubi a spirale, che sono coperti da uno strato di cellule muscolari provenienti dal disco genitale e uno strato di pigmento 24. È interessante notare che, testicoli larvali contengono solo cellule germinali di fasi di pre-meiotica e meiotiche fino alla fase spermatocita primaria, che corrisponde alla profase meiotica (vedi anche Figura 1) 23. Le prime coorti di cellule germinali maschili passano attraverso la meiosi durante la formazione puparium. A circa 24 ore APF, le fasi post-meiotico con flagelli allungata hanno già sviluppato, e tutti i nuclei contengono istone H2AvD-RFP (figure 1 e 2B). Nessuno degli spermatidi sono stati sottoposti tegli interruttore HP come nessun segnale ProtamineB-eGFP può essere rilevato mediante microscopia a fluorescenza (Figura 2C). Spesso, i testicoli sezionati in questa fase contengono una struttura auto-fluorescente di dimensione variabile che ricorda un agglomerato di cellule adipose o una a diverse gocce di olio (Figura 2C, punta di freccia). Questa struttura all'interno del testicolo è anche visibile con il microscopio a contrasto di fase. Ad oggi, non abbiamo trovato nessuna descrizione della sua natura nella letteratura. Testicoli sezionati a 36 ore APF appaiono allungate e in alcuni casi già cominciano ad arricciarsi (Figura 2D). Hanno già attaccato ai tessuti del tratto genitale che cresce fuori dalla genitale disco immaginale 23,24. Inoltre, esse contengono spesso i primi spermatidi oltre l'interruttore HP, come indicato dal segnale ProtamineB-eGFP (figure 1 e 2D, freccia). A 48 ore APF, i testicoli hanno ulteriormente allungato e chiaramente cominciano il curling alestremità prossimale. Diversi cisti germinali con nuclei protamina-positivi diventano visibili (Figura 2E, freccia).

Quando testicoli sezionati a 24 ore APF sono tenuti in coltura per 24 ore, non si allungano come nel volo intatto (confronta figura 2D e 2E con figura 6A '). Ciò è probabilmente dovuto alla mancanza di segnali di posizione e di crescita normalmente inviati dal tratto genitale sviluppo contattando il testicolo al suo punta posteriore 23,29. Inoltre, lo strato muscolare della guaina testicolo non si sviluppa perché miotubi nascenti non possono migrare dal disco genitale al testicolo 24. Solo il pigmento sottile strato non sembra la guaina-in questa situazione testicolo a crescere con sufficiente cultura per avvolgere il numero crescente di sviluppare cellule germinali all'interno. Tuttavia, le cellule germinali crescono, si dividono, e si differenziano in modo indipendente della guaina testicolo. Quindi, dopo più di 36 hr nella cultura, i primi testicoli frequentemente scoppiare aperto, e l'ulteriore sviluppo non viene rispettato. Tuttavia, entro un lasso di tempo più breve, è possibile registrare il time-lapse ex vivo le immagini in diretta di testicoli interi in via di sviluppo nella cultura, come evidenziato da figure 3A -3 C (vedi anche il video supplementare 1). Un testicolo pupa, sezionato a circa 45 ore APF, è stata incubata in media per 6 ore e ripreso ogni 5 min. In questo lasso di tempo, diverse cisti di spermatidi emergono dalla fase di switch HP e mostrano una (3A figure '-3 C, frecce aperte) segnale luminoso ProtamineB-eGFP.

Come accennato in precedenza, le cellule germinali maschili nel testicolo Drosophila sviluppano come fasci sincronizzati di cellule interconnesse, denominati cisti 1. Figura 4A mostra una panoramica delle cisti sezionato da un testicolo pupa a circa 24 ore APF. Le fasi di pre-meiotica, Stadi meiotiche, prime fasi post-meiotica, e cisti anche in fase precoce canoa con nuclei allungati prima di switch HP può essere trovato (figure 1 e 4B -4 E). Le cisti isolate sono molto fragili e devono essere maneggiati con cura. Le due cellule somatiche che formano busta della cisti possono essere facilmente interrotto meccanicamente. Cellule staminali germinali hanno la capacità di sopravvivere e continuare a dividere dopo l'ablazione genetica delle cellule cisti somatiche in vivo 30. E 'stato riportato che in vitro, le cellule germinali dello stadio a 16 cellule separate dal loro busta somatica ulteriormente sviluppare e differenziare 19. Infatti, abbiamo notato nel nostro sistema cultura che spermatociti presumibilmente fine completate divisioni meiotica con celle cisti perturbato, anche se molto di rado. Il più delle volte, queste cisti interrotto cessarono di sviluppo. A seguito del protocollo presentato, cisti intatti potrebbero in alcuni casi DEVElop ex vivo in terreno di coltura per un massimo di 72 ore. Tuttavia, abbiamo osservato che un numero ragionevole di cisti sopravvivere fino a 48 ore di incubazione. In questo lasso di tempo, le cisti coltivate sono in grado di sviluppare dal palco spermatocita primario fino a dopo le divisioni meiotica e dalla fase nuclei rotondo con cromatina base di istone-fino alla fase tardo canoa oltre la HP interruttore 12. Questo permette l'imaging dal vivo dei processi vitali in spermatogenesi, come per esempio, inserendo divisioni meiotica spermatociti (Figura 5 e video supplementare 2). Per questo esperimento, la RFP-tag istone variante H2AvD è stato utilizzato come marcatore cromosoma. La fase spermatocita primario si estende per circa 3 giorni in vivo 31. Pertanto, al fine di registrare divisioni meiotica, abbiamo scelto cisti con spermatociti che era visibilmente iniziato condensazione della cromatina (Figura 5A, regione 2). Divisione meiotica inizia a spermatocitisu un lato della cisti e poi seguito in un'onda nei restanti spermatociti (Figura 5A da regione a regione 2 1, vedi anche il video di riferimento 2). La condensazione della cromatina porta ben presto a cromosomi in rapido movimento che sono visibili come macchie luminose (Figura 5A, regione 2). Dopo 30 minuti, i primi spermatociti di questa regione sono già in telofase (Figura 5B, punte di freccia). I cromosomi della regione più giovane 1 organizzare al metafase piatto 20 minuti più tardi (Figura 5C). Si completa telofase e sono pronti a subire cytokinesis circa 15 minuti più tardi (Figura 5D). Anaphase, telofase e citocinesi è durato circa 10 minuti in questa registrazione (video supplementare 2).

Nei mammiferi, così come in Drosophila, un aumento marcato dell'istone H4 acetilazione segna l'inizio della rimozione degli istoni e l'interruttore HP durante la post-meioticaspermatogenesi 6,11. E 'stato proposto che questa modifica epigenetica è una componente essenziale o addirittura grilletto del programma di sviluppo della HP passare 10,32. In precedenza, abbiamo trattato Drosophila testicoli pupa in cultura con inibitori di targeting cappelli e HDAC di influenzare il livello di acetilazione dell'istone H4 durante le fasi post-meiotico 12. In questi saggi farmacologici, abbiamo scoperto che l'acetilazione degli istoni è essenziale per la progressione della spermatogenesi da stadi con base di istone-cromatina a tappe con cromatina a base di protamina-.

Figure 6 e 7 mostrano risultati rappresentativi di un test farmacologico con acido anacardic per cappelli in testicoli pupa bersaglio. Testicoli a 24 hr APF sono stati sezionati da un ceppo fly esprime H2AvD-RFP e ProtamineB-eGFP. Proteina ProtamineB-eGFP era assente in questi primi testicoli pupa (Figura 6A e B). Dopo 24 hr nella cultura, testicoli di controllo ha mostrato segnali ProtamineB-eGFP, che indicavano che i primi cisti avevano sviluppato oltre l'interruttore HP (figura 6A ', punte di freccia aperte). Questo non era il caso con i testicoli trattate con 150 mM acido anacardic (Figura 6B '). Testicolo preparati da squash e analisi di immunofluorescenza offrono informazioni più dettagliate (Figura 7). Nel controllo non trattato, i nuclei degli spermatociti primari relativamente grandi possono essere riconosciuti dal loro modello caratteristico di tre regioni del DNA riccamente colorato, che corrispondono alle grandi cromosomi (livello 4C) di Drosophila (Figura 7A, colonna 1). Acetilazione dell'istone H4 è chiaramente rilevabile in questa fase (Figura 7B, colonna 1). La prima fase dopo divisioni meiotica è conosciuta come la fase Nebenkern ed è caratterizzata da piuttosto grande, nuclei rotondo (vedere Figura 4C, non mostrato in figura 7,). La prossima tappa mostrato in Figura 7 è identificato da una crescita flagellare e la forma rotonda dei nuclei delle cellule germinali, che sono già molto più piccoli rispetto a fasi precedenti (Figura 7A, colonna 2) e mostrano molto bassi a livelli quasi non rilevabili di istone H4 acetilazione (Figura 7B, colonna 2). La forma rotonda poi allunga (Figura 7A, colonna 3), e l'acetilazione dell'istone H4 è di nuovo chiaramente rilevabile (Figura 7B, colonna 3). Gli spermatidi poi raggiungere lo stadio canoa forma in cui lo switch HP si svolge e istoni sono sostituite dalle protamine (Figure 7A - 7 C, colonne 4 e 5). Dopo la fase canoa, i nuclei protaminated poi ulteriormente allungare in una forma molto sottile ago in spermatozoi maturi (non mostrato qui).

Preparazioni Testicolo zucca di testicoli trattati con acido anacardic hanno mostrato risultati diversi (figure 7D </ Strong> - 7 F). La cromatina nelle cellule germinali trattate con acido anacardic appariva più condensata di quella del controllo non trattato (confronta Figura 7D, trattata e 7A, controllo). Immunofluorescenza analisi hanno rivelato che l'acetilazione di H4 è stata notevolmente ridotta o addirittura assente nei nuclei delle cellule germinali trattate con acido anacardic (Figura 7E). E 'noto che gli istoni altamente acetilati sono associati a regioni di cromatina aperta, mentre le regioni di cromatina che mancano di acetilazione degli istoni mostrano spesso una struttura repressiva 33. Pertanto, non è sorprendente che il trattamento con l'acido anacardic influenzato la struttura della cromatina dei nuclei delle cellule germinali trattate. È importante sottolineare che nessun nuclei protamina-positivi di fase avanzata canoa o oltre sono stati identificati in testicoli trattati (Figura 7F). Così, i nostri dati sono coerenti con l'idea che l'attività HAT è essenziale per la spermiogenesi procedere indietrocromatina alle fasi cromatina base protamina-m istone-based.

Figura 1 Panoramica di Drosophila spermatogenesi. Il pannello di sinistra mostra la sequenza delle fasi di sviluppo delle cellule germinali da una cellula staminale a sperma individualizzato. Disegni schematici mostrano la morfologia nucleare caratteristica delle cellule germinali. Uno spermatogonio divide per produrre 16 spermatociti interconnessi in una cisti. Durante questa fase la maggior parte delle trascrizioni necessarie allo sviluppo post-meiotico sono prodotti, translationally represso, e conservati. La maggior parte delle attività trascrizionale si conclude con l'entrata in divisioni meiotica. L'interruttore istone-a-protamina nella cromatina si svolge tra la fase di canoa precoce e tardiva. Fasi con cromatina a base istone-sono elevatiilluminato in rosso; stadi con cromatina a base di protamina-sono evidenziate in verde. Le barre nel pannello di destra indicano le tappe di cellule germinali che possono essere normalmente presenti nel testicolo di sviluppo in larve, pupe a circa 24 e 36 ore dopo la formazione puparium (APF), e mosche adulte.

Figura 2 Drosophila testicoli in diverse fasi di sviluppo. (A) immagine di fase-contrasto di un tutto-mount testicolo leggermente schiacciato di una larva terzo instar (L3). Solo fasi di pre-meiotica e meiosi può essere trovato. Spermatogoni sono limitate alla punta anteriore sotto la regione del mozzo (asterisco). Il testicolo rimanente viene riempito con spermatociti (freccia aperta). (B) immagine di fase-contrasto di un testicolo leggermente schiacciata a circa 24 ore dopo la formazione puparium (APF). Oltre a spermatociti (frecce aperte), il testicolo contiene spermatidi in fase Nebenkern (punte di freccia aperte), con nuclei rotondi e spermatidi in allungamento fasi con flagelli crescente (doppia freccia aperta) (C - E). Whole-mount testicoli pupa esprimere H2AvD-RFP e ProtamineB-eGFP (sovrapposizioni di contrasto di fase e eGFP e immagini RFP fluorescenza). (C) testicolo pupa sezionato a circa 24 ore APF. Arrowhead segna auto-fluorescenza delle cellule putativi del corpo grasso. D) pupa testicolo sezionati a circa 36 ore APF visualizza la prima cisti ProtamineB-eGFP-positivo (freccia). (E) pupa testicolo in circa 48 ore APF con un gruppo di cisti ProtamineB-eGFP-positivi (freccia). In tutte le parti figura, asterischi indicano la regione hub. Barre di scala: 100 micron.ank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 Immagini dal vivo dello switch istone-a-protamina in un testicolo pupa crescente ex vivo. (A) immagine di fase-contrasto di un testicolo pupa esprime H2AvD-RFP e ProtamineB-eGFP preso in cultura a circa 45 ore dopo la formazione puparium (APF). La vescicola seminale è indicato da una freccia piena. A paragonium (doppia freccia) rimane attaccato al testicolo. (A ') eGFP e RFP fluorescenza del testicolo mostrato in (A). La freccia aperta indica una cisti ProtamineB-eGFP-positivi. Scala bar:. 100 micron (B) Dopo 2 ore 30 min in cultura, diverse altre cisti (freccia aperta) emergere from la transizione istone-a-protamina. (C) Dopo circa un ulteriore 3 ore nella cultura, vale a dire, per un totale di 5 ore 29 min in cultura, un gruppo di cisti (freccia aperta) con segnale forte ProtamineB-eGFP è visibile alla fine prossimale del testicolo. Vedi anche il video supplementare 1. In tutte le parti figura, asterischi indicano la regione hub. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4 isolati cisti di cellule germinali a diversi stadi di sviluppo. (A) cisti sezionati da un testicolo a circa 24 ore dopo la formazione puparium (APF). Overlay di contrasto di fase e H2AvD-RFP fluorescenza (rosso) le immagini. Scala bar: 100 micron.(B - E) Ingrandimenti delle singole cisti di diverse fasi. Sovrapposizione di contrasto di interferenza differenziale (DIC) e immagini di fluorescenza H2AvD-RFP. Scala bar.: 20 micron (B) Cisti di 16 spermatociti (C) Cisti di 64 spermatidi rotondi in fase Nebenkern.. La struttura si sviluppa Nebenkern dai mitocondri fuse ed è visibile nelle immagini DIC vicino al nucleo (punta di freccia aperta). (D) cisti di spermatidi con nuclei rotonda H2AvD-RFP-positivi e allungamento flagelli (punta di freccia aperta indica una struttura Nebenkern allungamento che accompagna la crescente axoneme). (E) punta apicale di una cisti di spermatidi in fase precoce canoa che mostra una forma allungata nucleare. I flagelli ampiamente allungato sono solo parzialmente visibili. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questo fIGURA.

Figura 5 Immagini dal vivo di un singolo cisti di 16 spermatocita sottoposti a immagini di fluorescenza meiosi I ex vivo. Di una cisti nella cultura che esprimono H2AvD-RFP. Raffigurate sono fasi caratteristici della meiosi I. spermatociti in cisti passare attraverso divisioni meiotica in modo ondulatorio. (A) Cromosoma condensazione inizia in nuclei su un lato della cisti (2) e progredisce attraverso la cisti (direzione indicata dalla freccia ). I nuclei nella regione avversario (1) rappresentano una fase precedente della condensazione della cromatina, dove possono ancora essere individuate le regioni istone-densa che segnano le tre principali cromosomi. Spermatociti in regione (2) contengono cromosomi completamente abbreviato, visibili come macchie fluorescenti luminosi. (B) dopo il 300; min, i primi spermatociti in regione (2) sono in telofase (punte di freccia aperte), mentre condensazione cromosomica continua a regione (1) (C) Negli ultimi spermatociti della regione (1), i cromosomi (punte di freccia) sono disposti. in metafase piatto 20 min più tardi. (D) all'interno di un altro 15 minuti, gli ultimi spermatociti sembrano aver completato telofase e sono ora pronti a sottoporsi cytokinesis (punte di freccia aperta). Vedi anche il video supplementare 2 bar Scala:.. 50 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6 Anacardic acido inibisce l'interruttore istone-a-protamina in testicoli pupa in coltura. Testicoli pupa espressivo ng H2AvD-RFP e ProtamineB-eGFP e sezionato in 24 ore dopo la formazione puparium (APF) sono state incubate per 24 ore in terreno senza inibitore (controllo, A, A ', DMSO, dimetilsolfossido) o in terreno supplementato con 150 mM acido anacardic ( B, B '). Regioni Hub indicati da asterischi. (A, B) Nessun cisti ProtamineB-eGFP-positivi possono essere osservati dopo la dissezione. (A ') Dopo 24 ore di incubazione, alcune cisti sottoposti al istone-to-protamina switch e ProtamineB-eGFP-positivi cisti (punte di freccia aperte) possono essere osservati. (B ') Testicoli trattati con acido anacardic non sviluppano cisti ProtamineB-eGFP-positivi. Scala bar:. 100 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 7 acido Anacardic colpisce dell'istone H4 acetilazione e la struttura della cromatina di spermatidi preparazioni Squash di nuclei spermatidi da testicoli pupa (24 ore APF) esprime ProtamineB-eGFP incubato per 24 ore senza inibitore (A - C). O con 150 mM acido anacardic (D - F). DNA colorato con colorante Hoechst (A e D). Acetilazione H4 analizzato immunofluorescently (B ed E). Presenza di protamine monitorati con il segnale ProtamineB-eGFP (C e F). Dopo il trattamento con acido anacardic, la cromatina appare fortemente compattato (D) e il segnale H4 acetilazione è completamente ridotta in tutte le fasi di spermatidi (E). Inoltre, il anacardic-trattate con acidotesticoli non mostrano cisti di fase avanzata canoa o di là e nessun segnale ProtamineB-eGFP (F). Scala bar:. 10 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Supplemental Video 1 di imaging in diretta via eGFP e RFP fluorescenza dello switch istone-a-protamina in un testicolo pupa crescente ex vivo. Video di 6 ore di imaging corso tempo illustra la transizione istone-to-protamina dall'aumento della prevalenza di ProtamineB- cisti eGFP-positivi. Le immagini sono state acquisite ogni 5 min. Per i dettagli, vedere la Figura 3. (Vedere "suppl_video_1.MOV" sotto Downloads).

Supplemental Video 2 Immagini dal vivo di un singolo 16-spermatociti cisti in fase di meiosi I ex vivo. Time-lapse imaging fluorescente di uncisti in coltura esprimono H2AvD-RFP nel corso di 80 min. Questo video mostra le fasi caratteristici della meiosi I. Le immagini sono state acquisite ogni 1 min. Per i dettagli, vedere la Figura 5. (Vedere "suppl_video_2.MOV" sotto Downloads).

Gli autori non hanno interessi in competizione.