Questo rapporto descrive un metodo per misurare l'attività larvale di Drosophila utilizzando il TriKinetics Drosophila Activity Monitor. Il dispositivo utilizza raggi infrarossi per rilevare i movimenti di un massimo di 16 singoli animali. I dati possono essere analizzati per rappresentare i parametri di movimento, tra cui i tassi e le posizioni degli animali all'interno delle camere di saggio.
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Articolo metodologico
Misura della larvali attività nel
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le larve di Drosophila sono utilizzate in molti studi comportamentali, ma non è stato disponibile un semplice dispositivo per misurare i parametri di base dell'attività larvale. Questo protocollo ripropone uno strumento spesso utilizzato per misurare l'attività degli adulti, il monitor di attività TriKinetics Drosophila (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) per studiare l'attività larvale. Lo strumento è in grado di monitorare i movimenti degli animali in 16 provette di vetro da 8 cm, utilizzando 17 fasci di rilevamento a infrarossi per provetta. Il software di registrazione salva automaticamente i dati su un computer, registrando parametri come il numero di movimenti, i tempi di attivazione dei sensori e la posizione degli animali all'interno dei tubi. I dati possono quindi essere analizzati per rappresentare la locomozione complessiva e/o la preferenza di posizione, nonché altre misurazioni. Tutti i dati sono facilmente accessibili e compatibili con i software di grafica e manipolazione dei dati di base. Questo protocollo discuterà come utilizzare l'apparato, come far funzionare il software e come eseguire un saggio di attività larvale dall'inizio alla fine.
Introduzione
L'uso della Drosophila come strumento genetico ha trasformato la conoscenza scientifica dei sistemi biologici. Le larve di Drosophila sono state utilizzate in una varietà di studi tra cui nocicezione1, sviluppo2 e come modello per lo studio dei geni delle malattie umane3. L'attività della Drosophila comprende una serie di comportamenti che variano in diverse condizioni, tra cui le temperature2, l'esposizione a farmaci4 e tra i diversi genotipi. Tuttavia, nonostante l'uso significativo della larva come organismo modello, non è stato disponibile un metodo semplice e standardizzato per analizzare l'attività larvale. Attualmente, molti studi di locomozione larvale utilizzano sofisticati software di analisi video5. Sebbene potenti, la complessità di tali strumenti automatizzati può scoraggiare i laboratori che non sono già attrezzati per studiare la locomozione dall'includere l'analisi dei parametri di attività informativa nei loro studi. In altri metodi non automatizzati attuali, come l'analisi del grid crawling, il movimento viene valutato da un osservatore umano, il che introduce la possibilità di soggettività e limita la produttività a un animale alla volta6-7. Uno studio simile ha utilizzato un test di strisciamento a 5 corsie, che ha misurato il tempo impiegato dalle larve per percorrere una certa distanza lineare8. In tali saggi non automatizzati, viene misurato lo spostamento, ma ciò non tiene conto del viaggio non lineare tra i punti iniziale e finale. Come discusso di seguito, il metodo qui descritto tiene conto di una parte maggiore del movimento larvale effettivo, è oggettivo, facile da usare e offre una robusta produttività.
Per studiare facilmente il comportamento dell'attività larvale senza compromettere l'accuratezza, l'efficienza o il costo, questo metodo utilizza il TriKinetics Drosophila Activity Monitor (DAM), un dispositivo spesso utilizzato per studiare l'attività degli adulti. L'utilizzo di un unico dispositivo per studiare sia l'attività adulta che quella larvale è conveniente e consente un confronto diretto del movimento degli animali in queste due fasi della vita. Il sistema, caratterizzato dal più alto livello di risoluzione del produttore, utilizza 17 fasci di rilevamento a infrarossi per provetta, che registrano l'attività larvale quando i raggi del sensore vengono interrotti all'interno delle 16 singole provette. Il sistema salva quindi automaticamente le informazioni registrate su un computer, rendendole disponibili per la manipolazione con un software grafico di base. I dati ottenuti rappresentano i fasci che sono stati interrotti dalle singole larve (che possono essere convertiti in un tasso), il movimento quando una larva rimane all'interno di un raggio di rilevamento e la posizione degli animali all'interno delle camere di saggio durante un periodo di registrazione (consentendo di calcolare la preferenza di posizione). Il sistema è efficiente e relativamente semplice da utilizzare e offre un'analisi dell'attività di base altamente riproducibile alla portata di qualsiasi laboratorio che studia le larve di Drosophila.
Per dimostrare la potenza di questo test, vengono presentati dati che mostrano il suo utilizzo per verificare le differenze di attività derivanti dalla variazione delle temperature ambientali, nonché attraverso il confronto di un mutante precedentemente descritto come ipoattivo (iav1)9 con un controllo ampiamente analizzato (w1118).
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Protocollo
1. Preparazione di larve
- Per analizzare una larva desiderato per la locomozione o la preferenza di posizione, crescere le larve in condizioni standard per l'età desiderata per saggiare 10 utilizzando fly cibo standard 11.
- Fare un filtro a rete da stretching grado nylon serigrafica maglia su un imbuto. Fissare la rete al collo a imbuto con l'elastico. Inserire l'imbuto in un becher.
- Per raccogliere larve per l'analisi, paletta una spatola-pieno di cibo contenente foraggiamento larve dalla bottiglia coltura e lavare con acqua di rubinetto RT il filtro a rete, raccogliendo larve individuale direttamente dalla rete con un pennello 10.
2. Preparazione di Assay Tubes
- Per preparare per tappare le provette, bollire con attenzione un gel di agar 4% e versare in una capsula di Petri a una profondità di 1,5 cm. Ciò fornirà una spina per entrambi i lati del tubo quando animale è racchiuso. La soluzione al 4% è sufficientemente densa per evitare larve da penetrating i tappi.
- Assicurarsi che i tubi siano puliti e chiari prima dell'inserimento di larva. Se non lo sono, ciò può bloccare i movimenti vengano registrati.
- Per garantire larve ha umidità sufficiente per il movimento, preparare una spruzzetta contenente una piccola quantità di acqua calda. Capovolgere la bottiglia, orientare attentamente presa verso un lavandino e spremere delicatamente per espellere l'acqua dal tubo di prelievo.
- Inserire la presa della bottiglia nella provetta. Comprimere il flacone per fornire vapore acqueo nella provetta fino a visualizzare un sottile strato di condensa sulla parete del tubo. Video 1 mostra una larva muove in un tubo con una quantità appropriata di umidità.
- Per sigillare la larva nel tubo, rimuovere il gel di agar dello spessore di 1,5 cm dalla capsula di Petri e posizionare su una superficie mesh per permettere il flusso d'aria sotto l'agar in modo che una spina agar può essere inserito nel tubo. Premere un'estremità del tubo dosaggio nel gel due volte per inserire due tappi di gel in una delle estremità.
- Con un paintbcorrere, mettere una larva nel tubo di circa 1,5 pollici di profondità e sigillare il tubo premendo l'estremità più vicina la larva nel gel di agar. La pressione risultante costringerà il secondo tappo di gel di agar dall'estremità opposta e sigillare l'animale all'interno del tubo.
- Porre le provette nello dispositivo MB5 Multi-Beam Drosophila Activity Monitor (DAM) e regolare la posizione delle valvole in modo che gli animali non possono andare oltre il campo dei sensori.
- Per garantire che assay tubi non scivolare fuori infrarossi quadro di lettura del dispositivo durante il trasporto, tenere il tubo in posizione da un anello di fissaggio mastice intorno ogni tubo nel punto di contatto del dispositivo di registrazione.
3. Misurazione Attività
- L'attività di registrazione in un incubatore per evitare letture errate che possono verificarsi a causa di ombre, luci fluorescenti o alle variazioni di temperatura in laboratorio. Vedere Figura 5 per una disposizione suggerita del sistema.
- Impostare un incubatore a 20 ° C (vedi Figura 1). Per evitare falsi registrazioni dovuta a interferenze da fonti luminose ad incandescenza durante la registrazione, spegnere le luci fluorescenti e incubatori utilizzare una sorgente luminosa a LED separato durante la registrazione in incubatrice. Eseguire una prova senza animali per garantire che le condizioni di luce non aberrante innescare sensori. Non ci dovrebbero essere i dati di movimento registrati dopo questa prova.
- Lasciare che le larve si adatti alle impostazioni di incubazione 20 ° C per 5 minuti prima dell'inizio della dosaggio.
- Per impostare il sistema DAM a intervalli di registrazione desiderata (ad esempio, 1 min), garantire software di registrazione di sistema DAM viene scaricato sul computer host 12 e aprire il file di sistema DAM prima di collegare il camera di registrazione all'interfaccia psiu.
- Per impostare la frequenza di registrazione desiderata in cui verranno salvati i dati, selezionare le preferenze e quindi fare clic sopra o sotto l'opzione intervallo di lettura per selezionare differenti frazioni di tempo in cui i dativerrà memorizzato. Ad esempio, selezionare la lettura tempi di intervallo da 1 sec a 1 ora.
- Per selezionare il parametro che varia per la registrazione dei dati, scegliere le preferenze e quindi selezionare le caselle corrispondenti sotto tipo di dati in uscita (conti, movimenti, posizioni e dimorare, vedi Tabella 1). Ciascun parametro fornisce un'analisi unica dell'attività larvale all'interno del tubo.
- Per iniziare la registrazione, collegare il monitor al Modulo di interfaccia di alimentazione (psiu) tramite cavo telefonico CAB6. Collegare il psiu ad una presa di corrente. Una luce verde indicherà connessione appropriata.
- Collegare il psiu tramite un cavo Universal Serial Bus (USB) per un Macintosh o PC Windows per la registrazione dei dati. Aprire il programma DAM SystemMB1v6x sul computer per avviare automaticamente la registrazione dei dati.
- Dopo il tempo di raccolta desiderato è completo, selezionare Esci e quindi chiudere ora sullo schermo l'attività DAM; dati verrà salvato automaticamente sotto DAM dati di sistema. Prendete questo file di dati (ad esempio, monitorare 1) e trascinate in una cartella separata. Ciò memorizzare i dati grezzi dal software DAM in modo che possano essere successivamente elaborati.
4. Preparazione dei dati per l'elaborazione (DAM FileScan)
- Per elaborare i dati grezzi in un formato comprensibile aprire l'applicazione DAM FileScan selezionare Seleziona cartella dei dati di ingresso. Quindi scegliere la cartella di dati e il file desiderato, e selezionare l'opzione di scansione. Infine selezionare la lunghezza bin per il periodo di lettura desiderata. Ciò organizzare i dati grezzi in parametri impostati dall'operatore ed il programma riporterà i dati raccolti in quel particolare intervallo.
- Selezionare il tipo di dati di uscita per analizzare il movimento impostazione desiderata (conteggi del monitor, si muove, dimorano). Nel menu letture supplementari, somma selezionare in bin (questo è se la lunghezza bidone è maggiore dell'intervallo di lettura sistema selezionato).
- Nome del file in modo appropriato e salvare. Il file verrà memorizzato nella stessa posizione come la cartella dal punto 3.9.
- Al fine di raccogliere mosse media, elaborare i dati grezzi generati dal punto 4. Per generare una tabella in un foglio di calcolo, aprire il file che è stato salvato in precedenza (punto 4.3), e quando appare la finestra di importazione guidata testo, selezionare finitura per aprire i file di dati in formato foglio di calcolo.
Nota: A seconda del tipo di dati analizzati, il foglio di calcolo verrà letto in modo diverso. In genere per misurare monitorare movimenti o conteggi, il periodo di tempo di studio sarà registrato numericamente, mentre ogni tubo lettura individuale riceverà una lettera designata. Quando si visualizzano i dati nel foglio di calcolo, le colonne KZ rappresentano gli slot per provette 1-16 rispettivamente. Le righe rappresentano i punti di dati raccolti. - Ad esempio, se sono stati raccolti muove per 20 min a intervalli di 1 minuto, la media dei 20 righe per calcolare un numero medio di mosse / minuto e altre misurazioni.
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Risultati
La Figura 1 mostra i risultati di uno studio di risposta di temperature di controllo larve al terzo stadio, w 1118, utilizzando il dispositivo di monitoraggio per rilevare le differenze di locomozione larvale a sette diverse temperature. Le larve sono state lavate e collocato nel dispositivo dell'attività DAM come sopra descritto, e collocato in un incubatore alla temperatura desiderata. L'apparecchio è stato poi consentito di acclimatarsi all'ambiente per 5 minuti prima dell'...
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Discussione
Attività di larve di Drosophila è influenzata da una varietà di fattori, tra genotipo 8, 13 anni e la temperatura ambiente 2. Sebbene potenti metodi videografici capaci di analisi molto dettagliate sono state sviluppate da parte di coloro che studiano locomozione 5, questo livello di dettaglio può essere superfluo per coloro che desiderano per determinare i parametri di base di attività. Il metodo qui descritto si avvale di un dispositivo che è disponibile in molti laboratori, è...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da NIH P20GM103643 a I. Meng.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Drosophila Activity Monitor, Multibeam, 16 tubi, compresi i fili | TriKinetics Inc. | MB5 | |
| per Activity Monitor | TriKinetics Inc. | PSIU24 | |
| Tubi in vetro 80 x 5 mm per monitor di attività (100) | TriKinetics Inc. | PGT 5x80 | |
| DAMsystemMB1v6x per Macintonsh OSX (Intel) | www.trikinetics.com | download gratuito | |
| Software DAMFileScan 108x per Macintosh | www.trikinetics.com | download gratuito | |
| del software USB (PSIUdrivers.zip). | www.trikinetics.com | download gratuito | |
| DAMSystem Notes 308 | www.trikinetics.com | download gratuito | |
| Zeiss Stemi 2000C- Stereomicroscopio | Spectra Services | SP-STEMI2000C-BS | |
| Anidride carbonica | Maine Oxy | Pad per anestesia | |
| Fly Pad Genesee | 59-114 | superficie per lo smistamento di mosche anestetizzate | |
| Piccolo pennello | Winsor & Newton | #2 ROUND | o simile, utilizzato per lo smistamento di mosche anestetizzate |
| Rete serigrafica (160) | msj-gallery.com | SM160W63-3YD | La dimensione dei pori utilizzata in questo protocollo era ~ 0,1 mm |
| Tegosept | Genesee | 20-258 | conservante |
| Etanolo (190proof) | Pharmco | 111000190 | utilizzato per sciogliere Tegosept |
| 6 oz Bottiglia a fondo quadrato (PP) | Genesee | 32-130 | |
| "Flugs" per bottiglie di plastica | Genesee | 49-100 | |
| Fiale di Drosophila, larghe (PS) | Genesee | 32-117 | |
| Flugs per fiale di plastica larghe | Genesee | 49-101 | |
| Yellow Degerminated Corn Medal | , | ||
| Drosophila agar | LabScientific | FLY 8020 | |
| Lievito di Birra - | Farina di Re Artù | 1270 | |
| Zucchero Semolato - Domino |
Riferimenti
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