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Summary

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

Abstract

Di alta qualità carcinoma ovarico sieroso (HGSC), la causa di diffuse metastasi peritoneali, continua ad avere una prognosi estremamente sfavorevole; meno del 30% delle donne sono vivi a 5 anni dopo la diagnosi. L'omento è un sito preferito HGSC formazione di metastasi. Nonostante l'importanza clinica di questo microambiente, il contributo del tessuto adiposo omentale alla progressione del cancro ovarico rimane poco studiato. Adiposo omental è insolito in quanto contiene strutture note come macchie biancastre, che sono composti da B, T e cellule NK, macrofagi e cellule progenitrici circostanti nidi dense di vascolarizzazione. Macchie biancastre giocano un ruolo chiave nelle funzioni fisiologiche del omento, che sono necessari per l'omeostasi peritoneale. Abbiamo dimostrato che macchie biancastre anche promuovere il cancro ovarico colonizzazione metastatica di adiposo peritoneale, un passo fondamentale nello sviluppo delle metastasi peritoneali. Qui si descrivono gli approcci che abbiamo sviluppato per valutare e quantificare macchie biancastre in ogniitoneal adiposo e studiare il loro contributo funzionale di cellule di cancro ovarico colonizzazione metastatica dei tessuti omentali sia in vivo ed ex vivo. Questi approcci sono generalizzabile a modelli di topo e linee cellulari aggiuntivo, permettendo così lo studio della formazione di metastasi del cancro ovarico dalla localizzazione iniziale di cellule a strutture piatte lattee allo sviluppo di metastasi peritoneali diffuse.

Introduction

A differenza di molti tumori solidi, metastasi da carcinoma ovarico sieroso ad alto grado (HGSC) si limitano alla cavità peritoneale ^1. Così, efficaci terapie peritoneali potrebbero potenzialmente controllare o sradicare HGSC. Attualmente, un approccio terapeutico standard è citoriduzione chirurgica combinata con la chemioterapia ^1-3. Purtroppo, la stragrande maggioranza dei pazienti esperienza e soccombono a complicanze di recidiva di malattia. Queste statistiche tristi evidenziano la necessità di una migliore comprensione della colonizzazione metastatica, il processo attraverso il quale le cellule tumorali a localizzare, utilizzare, e proliferare in tessuti dell'ospite a formare metastasi ^2.

L'omento è un luogo preferito precoce di metastasi HGSC ^4-7. A differenza di altri adiposo peritoneale, il tessuto adiposo omentale contiene le strutture immunitarie insolite note come macchie biancastre, che contengono B, T e cellule NK e macrofagi, che svolgono un ruolo chiave nella homeos peritonealiTASIS ^8,9. Oltre alle loro funzioni fisiologiche, abbiamo scoperto che macchie biancastre svolgono un ruolo attivo nel carcinoma ovarico colonizzazione metastatica ^4. Nei saggi metastasi sperimentali, SKOV3ip.1, CaOV3, e HeyA8 (umana) e ID8 (murino; C57BL / 6) cellule di cancro ovarico rapidamente a casa per macchie biancastre, suggerendo che le cellule si stanno muovendo verso un fattore chemiotattico secreto. È interessante notare che le cellule tumorali non colonizzare adiposo peritoneale privo macchie biancastre (cioè, gonadici e grasso ^uterina) 4.

Al fine di identificare i meccanismi che regolano la colonizzazione macchia lattiginosa, abbiamo ottimizzato i modelli di xenotrapianto che consentono l'interrogatorio di eventi cellulari e molecolari nel corso tempo della colonizzazione metastatica ^4. Un vantaggio specifico degli approcci qui descritti è la sua enfasi sulla architettura tissutale e la funzione, che consente agli utenti di testare le ipotesi in completamente integrato in vivo e ex vivo modelli di metastatic ^4,10 colonizzazione. Confrontando la localizzazione e la crescita delle cellule tumorali nei depositi di grasso peritoneale che o contengono o mancano di macchie biancastre, i ricercatori possono testare il contributo relativo (s) di adipociti e cellule all'interno macchie biancastre per l'alloggio e la progressiva crescita delle cellule di cancro ovarico in tessuti fisiologicamente rilevanti.

Protocol

Tutti i topi sono stati alloggiati, mantenute e eutanasia secondo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) le linee guida e sotto la supervisione dell 'Università di Chicago Resource Center animale. 1. Gli animali Preparazione di studi sperimentali Consentire agli animali di acclimatarsi a nuove abitazioni e ambiente, per recuperare da potenziali effetti fisiologici di trasporto e movimentazione. Nota: La seguente tecnica è applicabile a tutti i ceppi di topi disponibili in commercio. Il numero di animali da utilizzare per un esperimento dipende dal disegno dello studio e dovrebbe essere fatto con la consultazione da un esperto di statistica. 2. Identificazione e isolamento di peritoneale Fat Depositi. L'eutanasia degli animali tramite CO 2 overdose e un metodo fisico secondario per confermare la morte. Come la raccolta depositi di grasso peritoneale costituisce la rimozione degli organi interni (metodo secondaria), make un'incisione mediana vicino alle papille inguinale attraverso la parete peritoneale per esporre gli organi interni (Figura 1A). Per il omentale Grasso (OM), esporre il complesso omentale / pancreas, estendendo la milza dalla cavità peritoneale con una pinza (Figura 1C). Rilasciare omento dal pancreas e la milza strettamente rifilatura tutte le connessioni dei tessuti. Assicurarsi che ogni tessuto pancreatico residuo viene asportato 4. Per il gonadica Grasso (GF), utilizzare pinze per sollevare il grasso gonadica circonda le ovaie e accise tagliando le connessioni dei tessuti (Figura 1A superiore de stra) 4. Per il uterino Grasso (UF), utilizzare pinze per sollevare il grasso uterino che circonda le corna uterine e accise tagliando le connessioni dei tessuti (Figura 1A in basso a destra) 4. Per la mesenterica Fat (MF), tagliare la giunzione tra l'intestino tenue e il piloro. Utilizzare pinze per afferrare saldamente l'estremità liberatenue, e lentamente "buccia" lontano dal grasso mesenterico. Rilasciare il grasso mesenterico dalla radice mesenterica con le forbici dissezione (Figura 1A in basso a sinistra) 4. Per la Splenoportal Fat (SF), sollevare l'estremità distale della milza con pinze per esporre la banda di tessuto adiposo sottile collegamento all'ilo della milza al pancreas. Asportare il grasso splenoportal dapprima svincolandola dal pancreas, e poi accuratamente analizzarlo dalla milza (Figura 1B) 4. 3. Lattea Spot Identificazione Utilizzando Giemsa Excise omenta (fare riferimento al punto 2.3) da topi C57BL / 6 e fissare in 5% formalina tamponata neutra a 4 ° C per 16 ore (O / N). Per inclusione in paraffina tessuto fissa, scegliere uno stampo che è appropriato per la dimensione del tessuto. Versare paraffina fusa dal serbatoio di paraffina per riempire lo stampo. Aprire la cassetta e utilizzando caldo perfunghi porcini, trasferire il tessuto nello stampo. Orientare con attenzione i tessuti durante l'incorporamento paraffina per la produzione di sezioni longitudinali. Posizionare la cassetta tessuto etichetta sopra la modanatura e premere saldamente in posizione. Lasciare lo stampo raffreddare per almeno 30 minuti. Tagliare sezioni seriali (4 micron di spessore) dalla paraffina fissati in formalina (FFPE) blocco del tessuto incorporato. Posizionare un vetrino predepurata sotto sezioni come il nastro di tessuto viene fuori il blocco di paraffina. In serie sezione tutta omento; raccogliere e macchiare ogni terza sezione per Giemsa (vedi 3.6). Lasciare che il vetrino con le sezioni di aria secca, preferibilmente O / N a temperatura ambiente. Diapositive secchi sono pronti per il fissaggio. Colorare la prima sezione per ematossilina eosina per paragoni con vetrini colorati Giemsa. Deparaffinare i vetrini da due sequenziali 5 min incubazione in xileni. Reidratare diapositive da due incubazioni sequenziali nel seguente: etanolo 100%, 95% etanolo e infine toccare water. Prendere precauzioni adeguate per evitare le diapositive si asciughi. Eseguire tutti i passaggi a temperatura ambiente. Completamente immergere i vetrini in una vaschetta Coplin contenente 5% soluzione Giemsa (w / v preparata in acqua di rubinetto) e incubare per 4 minuti a temperatura ambiente. Sciacquare i vetrini in acqua di rubinetto per 60 secondi, asciugare e montare con coprioggetto utilizzando supporti di montaggio. Immagine dei vetrini colorati con uno scanner diapositive intero e di processo con il software del produttore. Quantificare il volume posto lattiginoso in sezioni omentali Giemsa-macchiati utilizzando il software ImageJ 4. 4. Propagazione e preparazione di cellule di cancro ovarico in vivo e ex vivo Studi Pre-caldo 15 ml di terreno di coltura delle cellule a 37 ° C in un bagno di calore. Preparare un tessuto pallone di coltura di dimensioni appropriate (ad esempio, 75 centimetri zona 2 di superficie), mediante l'etichettatura con il nome di linea cellulare, il numero di passaggio, data e persona che ha preparato il brodo congelato, e la datae persona che è lo scongelamento / placcatura le cellule. Nota: Negli studi di metastasi tali informazioni dettagliate è di fondamentale importanza, come la data di congelamento giù e il numero di passaggio può influenzare il fenotipo metastatico. Utilizzando l'ambiente sterile della cappa biologica, pipetta 10 ml di terreno nel pallone T-75 cultura. Rimuovere una fiala di cellule del sistema azoto liquido e controllare l'etichetta per confermare il tipo di cellula. Scongelare solo una fiala di cellule in un momento riscaldando a 37 ° C bagno di calore. Usando una tecnica sterile, pipetta 1×10 6 cellule scongelato nel pallone cultura. Porre il pallone in incubatrice per permettere alle cellule di allegare. Oscillare delicatamente il pallone avanti e indietro in modo da formare una sospensione cellulare uniforme. Posizionare pallone in coltura tissutale incubatore e mantenere a 37 ° C in 5% CO 2 ambiente. Consentono alle cellule di aderire O / N. Aspirare il terreno, e sostituirli con fresco terreni di crescita pre-riscaldata. Porre il pallone in incubatrice e tuttiow cellule a crescere. Monitorare la crescita delle cellule quotidiano mediante ispezione visiva ogni 2-3 giorni con un microscopio invertito. Utilizzare le tecniche standard di coltura cellulare alle cellule di passaggio dopo aver raggiunto il 70-80% di confluenza. Nota: Per i saggi sperimentali raccolgono le cellule a 70% di confluenza per assicurare che le cellule siano attivamente proliferando. Aspirare il terreno di coltura e risciacquare con 10 ml di fosfato sterile salina tamponata (PBS). Aspirare PBS e aggiungere 0,25% tripsina / EDTA (da 2 a 3 ml per 75 cm 2 di superficie) e incubare 5 minuti a 37 ° C. Visivamente confermano che le cellule sono staccati e aggiungere un uguale volume di mezzo di crescita, e pipettare delicatamente le cellule su e giù per ottenere una sospensione di cellule singole. Nota: E 'fondamentale che il terreno di coltura contiene siero come inattiva tripsina. Preparare almeno 2 a 4 volte più cellule rispetto al numero richiesto per un dato esperimento per compensare la perdita di cellule durante fasi successive Determinare la percentuale di cellule vitali insospensione via trypan saggio esclusione blu utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato. Nota: Qui, usare solo preparazioni di cellule in cui ≥ 96% delle cellule sono vitali. Trasferire la sospensione cellulare dal pallone in una provetta conica da 50 ml. Cellule pellet di centrifugazione 5 min a 1.100 xg, a 4 ° C Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in PBS ad una concentrazione di 2×10 6 cellule per ml. 5. Iniezione intraperitoneale di cellule Nota: Nei nostri esperimenti, i topi sono gestiti in un flusso d'aria laminare o armadio biosicurezza all'interno della nostra struttura barriera al fine di limitare il rischio di esposizione patogeno, Al fine di dimostrare chiaramente questa tecnica, le procedure nel video che accompagna sono stati condotti in un laboratorio riconosciuto per il lavoro degli animali. Questa particolare tecnica non richiede che gli animali erano sotto anestesia. Sotto protocolli approvati, eseguire questa technique su animali vivi. Utilizzare ceppi appropriati di topi per questo studio. Per esempio: usare immunocompromessi, topi nudi atimici per lo studio di cellule di cancro ovarico umano (SKOV3ip.1, e HeyA8) colonizzazione; utilizzare immunocompetenti C57BL / 6 topi per lo studio di topo cellule di cancro ovarico (ID8) colonizzazione. Carico 500 microlitri della sospensione singola cella nella siringa e mettere in sterile ricoperto ago da 25 G. Questo riduce taglio cella prima dell'iniezione. Scegli il mouse verso l'alto per la collottola e tenere la coda con il palmo della mano e l'indice e fissare la zampa posteriore sinistra tra l'anello e mignolo (quando il mouse è trattenuto con la mano sinistra). Nota: per evitare organi addominali traumatizzanti, frenare il mouse bene in modo che non possa muoversi durante l'iniezione. Immaginate una linea attraverso l'addome appena sopra le ginocchia, e individuare un punto sul lato destro dell'animale e vicino alla linea mediana. Il punto di entrata è cranica e leggermente medialedell'ultimo capezzolo. Nota: Inserendo l'ago sul lato destro del mouse evita il cieco e riduce il rischio di puntura intestini 11. Inserire l'ago in corrispondenza della zona inferiore laterale dell'addome del topo ad una profondità di circa 0,5 cm. Tirare indietro lo stantuffo per confermare che l'ago non è penetrato in un vaso sanguigno o di altri organi peritoneali. Se il liquido viene aspirato scartare la siringa (e campione) 11. Un aspirato verde-marrone o giallo indica la penetrazione dell'ago nel dell'intestino o della vescica, rispettivamente. Iniettare il campione utilizzando lento, la pressione costante. Ritirare l'ago e restituire il mouse per la sua gabbia. Non richiudere la siringa prima dello smaltimento in apposito contenitore. Topi Sacrifice via di CO 2 asfissia e la rimozione degli organi vitali in punti temporali specifici dopo l'iniezione. 6. Lattea colonizzazione posto in vivo Quantitazione della localizzazione delle cellule tumorali di macchie biancastre con citometria a flusso Isolare depositi di grasso peritoneale da topi (come descritto nel passaggio 2,3-2,7) iniettati con fluorescenza tagged cellule tumorali e tessuti posto immediati PBS ghiacciato. Per questa particolare tecnica, il peso-partita tutti i tessuti adiposi di grasso al omento. Tessuti trasferimento per separare 5 ml provette contenenti 1,5 ml di DMEM senza siero e 0,1% (w / v) di albumina di siero bovino. Piscina tessuti raccolti da tre topi indipendenti al fine di garantire un rendimento sufficiente di cellule per citometria a flusso. Tessuti Triti utilizzando forbici chirurgiche e aggiungere 1,5 ml di DMEM senza siero contenente 0.4% (w / v) collagenasi I. Incubare la sospensione di tessuto a 37 ° C per 30 minuti con miscelazione rotazionale. Come passaggio facoltativo, dissociare ulteriormente il tessuto dalla masticazione. In questo caso, trasferire la sospensione tessuto-collagenasi ad un sacchetto microstomacher, masticate per 10 min in basso, ruotando l'orientamentodei sacchi dopo 5 min. Filtrare i campioni attraverso un filtro a maglia di nylon (60 micron pori) per rimuovere i detriti più grandi. Raccogliere le cellule tramite centrifugazione a 250 xg per 5 minuti a 4 ° C e scartare il surnatante. Risospendere il pellet di cellule in 100 microlitri di PBS combinati con 900 ml di tampone di lisi ACK e incubare a temperatura ambiente per 1 min. Cellule centrifugare a 250 xg per 5 minuti e scartare il surnatante. Risospendere il pellet di cellule in 250 microlitri di PBS ghiacciato. Filtrare i campioni attraverso una maglia di nylon pori 60 micron per garantire sospensione singola cella. Lavare il filtro con 250 ml di PBS ghiacciato. Quantificare il numero di cellule con targhetta fluorescenza nella popolazione utilizzando un citofluorimetro equipaggiato con un laser giallo-verde 561 nm e / 15 nm filtro passabanda 585 nm. Impostare la porta per le celle tdTomato positive basate sull'analisi delle cellule parentali e / o opportuni controlli negativi 4. </ol> La quantificazione delle metastasi microscopiche e macroscopiche Al punto finale sperimentale desiderata (s), isolare, e subito mettere i tessuti nei media fissaggio appropriati. Fissare i campioni più grandi, come gonadica intatto, uterino, e depositi di grasso mesenterica nel 10% formalina tamponata neutra per 48 ore a 4 ° C. Fissare campioni più piccoli (omentale e grassi splenoportal, così come equivalenti di tessuto di uterina e grasso mesenterico) nel 5% formalina tamponata neutra a 4 ° C per 2-16 ore. In alternativa, a scatto congelare i tessuti mettendoli in un mezzo di congelamento, come Office e cadere in una quantità appropriata di azoto liquido. Trasferimento tessuti al 70% di etanolo e conservare fissato a 4 ° C fino inclusione in paraffina. Incorporare e tessuti processo come descritto in 3.2 e 3.3. Utilizzare la sezione H & E macchiato valutare tessuti per la presenza o assenza di metastasi microscopiche (cioè, gruppi di 50 cellule). Conferma tegli presenza di metastasi microscopiche con un metodo secondario, come una macchia d'IHC per citocheratina 8/18 per rilevare cellule di cancro ovarico. 7. Lattea Spot Colonizzazione Ex Vivo Istituzione di ex vivo condizioni di base di coltura di organi omental Posizionare ogni omento in un unico inserto piastra di coltura e posto all'interno di un pozzetto di una piastra di coltura tissutale dodici pozzetti contenenti 500 ml di DME media / F12 contenente il 20% di FCS. Mantenere colture d'organo a 37 ° C in un ambiente di 5% CO 2 per 24 ore al 48 e / o punti di tempo supplementari. Utilizzare tre omenta indipendente (campioni in triplo) per ogni condizione (ad esempio, tipo di supporto punto di tempo /). Per confermare l'integrità dei tessuti alle estremità sperimentali, correggere e campioni di processo come descritto al punto 3. Contando sani contro adipociti necrotiche su H & E sezioni in grado di valutare l'integrità dei tessuti. Un minimo di ~ 120 cellule da5 campioni biologici è tenuto a formulare una percentuale di tessuto vivo presente 10. Per misurare la funzione del tessuto, posto omenta (n = 3) in pozzetti separati di un 24-pozzetti contenenti 500 ml di DME media / F12 con 20% FCS. Lasciare omenta per condizionare i supporti a 37 ° C in un ambiente di 5% di CO 2 per 24 ore, e quindi rimuovere 250 microlitri per l'uso in un IL-6 ELISA 10. Ex vivo co-coltura del omento mouse con cellule SKOV3ip.1-GFP Crescere e preparare cellule fluorescente contrassegnati come descritto nel capitolo 4 e risospendere ad una concentrazione di 2 × 10 6 cellule per ml. Applicare ~ 6 ml di tessuto adesivo alla membrana dell'inserto coltura e lasciare asciugare all'aria. Lavare la membrana due volte con acqua sterile per rimuovere l'adesivo in eccesso. Far asciugare le membrane sotto una cappa laminare. Accise cautela il omenta e attaccarlo al memb adesivizzatorane con pinza sterile. Lasciare il tessuto di aderire alla membrana per 1 min prima di aggiungere supporti. Aggiungere 500 microlitri della sospensione cellulare sopra l'omento in ogni inserto cultura. Riempire l'area attorno alla camera transwell con 2,5 ml di DME / F-12 10. Incubare omenta con sospensione cellulare per 6 ore a 37 ° C in un ambiente di 5% di CO 2. Rimuovere con cautela e lavare il omenta con ~ 10 ml di PBS. Visualizza fluorescente foci di cellule di cancro utilizzando un sistema di imaging a fluorescenza adeguato 10.

Representative Results

Identificazione e istologico Esame dei peritoneale Fat Depositi Dissezione anatomica Gross consente l'identificazione di quattro dei cinque fonti primarie di grasso peritoneale (Figura 1A). Spostamento in senso orario dal centro in alto sono: l'omento (OM; descritto) che si trova sopra lo stomaco e la milza, il grasso gonadico (GF) che circonda l'ovaio sinistro (ov), il grasso uterino (UF) attaccato alle corna uterine (uh) e il mesentere (MY) col…

Discussion

Sviluppo di terapie per colpire le cellule Disseminata richiede una comprensione meccanicistica della colonizzazione metastatica, il primo passo fondamentale per lo sviluppo della malattia peritoneale. Per affrontare questi problemi riportiamo approcci che possono essere utilizzati per discernere come composizione del tessuto unico del omento e l'architettura promuovere cancro ovarico colonizzazione metastatica. Segni particolari del nostro approccio sono: 1) l'attenzione sui primi eventi del processo d…

Materials

Dissection Tools	Fine Science Tools	NA
Geimsa	Fluka/Sigma Aldrich	48900
5% Formalin	Sigma	HT501320
DMEM	Corning	10-013-CV
Trypsin	Gibco	25200-056
PBS	Corning	21-040-CV	Without calcium and Magnesium
26 gauge needle	BD	329652
BSA	Sigma	A7906
Collagenase	Worthington	LS004196
Stomacher	Seward Labsystems	Stomacher 80 Biomaster
Microstomacher bag	Stomacher Lab Systems	BA6040/Micro
ACK Lysis Buffer	Gibco	A10492-01
Millicell culture plate insert	Millipore	PICM01250
Cell-Tak	BD	354240