Introduction
Le contrôle des mouvements est une fonction essentielle du système nerveux central (SNC). Motricity est le principal résultat mesurable de la fonction du système nerveux central et la possibilité pour les individus principale d'interagir avec le monde extérieur. Comprendre les principes de la fonction motrice et les mécanismes qui sous-tendent l'apprentissage d'une tâche motrice est actuellement l'un des grands défis des neurosciences. Les modifications morphologiques, physiologiques et moléculaires ont été trouvés lors de l'acquisition d'une nouvelle tâche motrice. Par exemple, la forme et le nombre de synapses changent en réponse à la formation de l'homme moteur 1-5, et des modifications fonctionnelles de la machine synaptique ont été observés après l'apprentissage moteur. Les réponses synaptiques étaient plus élevés dans les connexions de la région de la patte avant-représentant du cortex moteur formé par rapport à l'hémisphère non formé du même animal ou à des réponses des animaux non entraînés 6,7. Observations électrophysiologiques suggèrent également que la potentialisation à long terme (LTP) et de tempsla dépression -term (LTD) comme mécanismes lieu lors de l'apprentissage d'une nouvelle habileté motrice, et que la plage de fonctionnement synaptique, qui est défini entre les frontières qui limitent de LTP et LTD saturation, est modifié 8. En outre, il a été démontré que les marqueurs de l'activité et de la plasticité promotion de molécules telles que c-fos, GAP-43, ou BDNF mais aussi plasticité molécules inhibitrices telles que les rôles réglementaires Nogo-A affichage lié à l'apprentissage pour la plasticité neuronale 9-16.
Ces progrès vers une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents de l'apprentissage moteur ne pourraient être atteints avec l'utilisation de paradigmes comportementaux qui permettent un contrôle précis de l'acquisition d'une nouvelle compétence de moteur, par exemple, qualifiée forelimb envergure. Seule une tâche comportementale bien structuré permet de surveiller et capturer les modifications corrélatives qui se produisent lors de l'apprentissage et de l'exécution de la tâche respective. Ici, nous démontrons visuellement une version modifiée de la patte antérieure hommeseul culot tâche atteindre chez les rats adaptés de Buitrago et al. 17 Le paradigme présenté permet l'analyse de l'acquisition de mouvement à l'intérieur d'une session d'entraînement quotidien (au sein de session) représentant la composante d'apprentissage rapide et l'acquisition primaire ainsi que qualifiés apprentissage moteur sur plusieurs séances (entre-session) représentant la composante d'apprentissage lent et l'entretien de la tâche appris 18. Surtout, ce paradigme comportemental augmente le degré de difficulté et la complexité de la tâche de la motricité en raison de deux caractéristiques: d'abord, les rats sont entraînés à tourner autour de leur axe après chaque prise et donc à réaligner leur corps avant la prochaine portée de granulés et de renouveler l'orientation du corps, ce qui empêche l'exécution d'un mouvement constant à partir du même angle. Deuxièmement, les pastilles sont extraites à partir d'un montant vertical placé à l'avant de la cage. En raison du petit diamètre de la poste, des pastilles peuvent être facilement débuté nécessitant une connaissance précise pour la récupération réussie et prévenir simple, tirant de la pastille vers l'animal.
Ces tests comportementaux complexes permet une compréhension plus profonde sur les mécanismes qui sous-tendent l'apprentissage moteur. Par rapport à des souris, des rats sont supérieurs dans leur exécution des tâches comportementales complexes et donc mieux adapté pour paradigmes complexes tel que présenté dans cette étude. Vu les possibilités croissantes génétiques disponibles pour les rats 19,20, la combinaison de méthodes d'essai de comportement précises et bien contrôlées avec les manipulations génétiques, l'imagerie et les techniques physiologiques représente une boîte à outils puissante pour mieux comprendre les bases neurobiologiques de l'apprentissage moteur et la mémoire.
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Protocol
Toutes les expériences ont été réalisées en conformité avec les directives de l'Office vétérinaire du canton de Zurich, en Suisse.
1. manipulation des animaux et de l'habituation
- Manipulation des animaux
Note: 5 jours avant le début de l'expérience, effectuer l'étape 1.1.1 quotidienne.- Pour les expériences comportementales, habituer les animaux à l'expérimentateur. Ont quotidienne manipulation sessions d'une durée de 10-15 minutes par animal. Nettoyez la boîte après la session de chaque animal.
- Initialement, placer la main de l'expérimentateur dans une cage permettant à l'animal à explorer et à sentir, à se familiariser avec l'expérimentateur.
- Ensuite, soulevez doucement l'animal avec la main de l'expérimentateur d'une manière sûre en le saisissant par le corps du rat entre les pattes guichet et arrière permettant familiarisation.
- Peser chaque animal tous les jours pour obtenir un poids de base avant la privation de nourriture.
- Appareil accoutumance et familiarisation alimentaire
- Peser chaque animal tous les jours pour obtenir un poids de base avant la privation de nourriture.
- Lancer alimentaire privant rats 3 jours avant le début de la pré-formation sur un régime standard de laboratoire. Donnez rats 0,05 g de nourriture par 1 g de poids corporel par jour (par exemple, un rat pesant 200 g, commencer avec 10 g de nourriture). Veiller à ne pas diminuer le poids corporel plus de 10% par jour en surveillant poids corporel par jour.
- Si plusieurs animaux sont détenus dans une cage, les rats dominants peuvent manger plus que les moins dominants. Dans le cas où le poids de un diminutions des animaux, nourrir l'animal séparément au lieu de l'alimentation en groupe. Donner de l'eau ad libitum.
- Pour connaître le rat avec l'appareil de préhension, placer l'animal dans la boîte de la formation (Figure 1). Avoir des pastilles de sucre placés dans la boîte de formation à proximité de l'ouverture de la fente de familiariser l'animal avec les boulettes de nourriture. Effectuez cette step 10-15 min par jour pendant 3 jours.
2. Pré-formation et l'apprentissage moteur de Skill
- Pré-formation
- Un jour après la familiarisation, placer l'animal dans la boîte de la formation et de placer le culot de près à l'ouverture de la fente de sorte qu'il peut être atteint par la langue de l'animal. Exclure les animaux qui récupèrent pellets avec leur patte avant lors de la pré-formation
Remarque: A ce stade, la récupération de culot avec la langue est crucial et généralement la méthode de choix de l'animal. Pellets doivent être en aucun cas saisir avec le membre antérieur jusqu'à ce que le premier jour de l'apprentissage moteur de compétences pour permettre une surveillance adéquate de la tâche atteindre appris. Récupération Pellet avec le membre antérieur lors de la pré-formation est un critère d'exclusion et dans la plupart des cas non observés. - Enseigner le rat soit exécuter à l'arrière de la cage et revenir à l'ouverture de la fente ou du recul et de tourner autour de son propre axe afin de recevoir la prochaine boulette de nourriture avecla langue. Prévoyez du temps pour l'animal à explorer la cage, courir à l'arrière et revenir à l'ouverture de la fente. Si l'animal ne l'exécute pas correctement la tâche, utilisez une pince à taper doucement à l'arrière de la cage de fin et attirer l'attention de l'animal. Une fois que l'animal est à l'arrière, tapotez doucement sur le devant de la cage pour guider l'animal à l'ouverture de la fente.
Remarque: Une fois que l'animal atteint une valeur standard définie (par exemple, 50 récupérations de granulés de succès avec la langue en moins de 15 min), l'animal se qualifie pour la phase moteur d'apprentissage de compétences. Au jour 1 et 2 de la pré-formation, les apprenants peuvent déjà se distinguer des non-apprenants. Non-apprenants peuvent être exclus de l'étude à cette étape. Ceci diminue la probabilité d'avoir un nombre élevé de non-étudiants au cours de l'étape d'apprentissage du moteur (2.2). - Pendant la pré-formation, de la nourriture priver rats à un régime standard de laboratoire. Donner de l'eau ad libitum. Surveiller poids corporel par jour pendant toute l'étude. Fairepas utiliser même pièce pour former rats mâles et femelles. Assurer un environnement calme et sans bruit pour l'animal.
- Un jour après la familiarisation, placer l'animal dans la boîte de la formation et de placer le culot de près à l'ouverture de la fente de sorte qu'il peut être atteint par la langue de l'animal. Exclure les animaux qui récupèrent pellets avec leur patte avant lors de la pré-formation
- Détermination de Paw préférence et l'apprentissage moteur de Skill
- Au cours de la première session de l'apprentissage des habiletés motrices, remplacer la glissière en face de la fenêtre avec un message. Placez le culot de sucre d'environ 1,5 cm de la fenêtre sur le poste afin que l'animal ne peut pas atteindre le culot avec sa langue, mais seulement le récupérer par un membre antérieur précise atteindre et saisir le mouvement.
- Pour appliquer la récupération de granulés par le membre antérieur, utilisez une pince à porter doucement le culot près de la bouche de l'animal et se rétracter le culot alors que l'animal tente la consommation avec la langue. Effectuer cette tâche répétitive jusqu'à l'animal étend la patte antérieure et saisit une pastille.
- Placer le poste central à l'ouverture de fenêtre. Pour déterminer la préférence de la patte, observer attentivement les 10 premiers essais le jour de la formation 1. Plus de 70% de la réactentatives hing (ie, 7 sur 10) doivent être exécutées avec la même patte avant. Si cela ne soit pas atteint, passez à une autre série de 10 essais jusqu'à ce que le seuil de 70% est atteint.
- Après la détermination de la préférence de la patte, passer le poteau en direction de la patte antérieure préféré et aligner au centre de la bordure de l'ouverture de la fenêtre. Des moyens d'alignement de la patte préféré le poste est décalé contraire à la patte respective pour permettre un angle optimal pour atteindre (figure 1B, C).
- Classer un procès, définie comme une nouvelle pastille présenté à l'animal, autant de succès (atteindre, saisir, récupérer et manger le culot), chute (atteindre, saisir et perdre granulés lors de la récupération) ou échouer (frapper culot sur le poteau). Notez toutes les épreuves dans votre feuille et analyser les données après l'expérience.
- Effectuer une séance quotidienne constitué par un nombre défini d'essais (par exemple, 150) ou d'un temps maximum (par exemple, 1 heure) pour chaque animal.
- Enquêter sur la précision et de réglage findu mouvement en utilisant la première analyse de tentative. Une première tentative est définie en saisissant de la pastille en un seul mouvement monolithique sans interruption, l'hésitation ou la répétition de composants de mouvement individuels. Observer attentivement chaque portée par le rat.
- Si le rat hésite ou se rétracte au cours d'une portée ou tente plusieurs essais à saisir correctement le culot, noter le procès respectif comme un succès, mais pas la première tentative. Si l'animal saisit avec succès le culot dans une seule portée monolithique, notez le procès respectif autant de succès première tentative dans une colonne distincte dans votre feuille.
- Au cours de l'apprentissage moteur de compétences, de la nourriture priver rats à un régime standard de laboratoire. Donner de l'eau ad libitum. Surveiller poids corporel par jour pendant toute l'étude.
- Au cours de la première session de l'apprentissage des habiletés motrices, remplacer la glissière en face de la fenêtre avec un message. Placez le culot de sucre d'environ 1,5 cm de la fenêtre sur le poste afin que l'animal ne peut pas atteindre le culot avec sa langue, mais seulement le récupérer par un membre antérieur précise atteindre et saisir le mouvement.
- Pour les expériences comportementales, habituer les animaux à l'expérimentateur. Ont quotidienne manipulation sessions d'une durée de 10-15 minutes par animal. Nettoyez la boîte après la session de chaque animal.
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Representative Results
L'acquisition de compétences réussi du moteur est obtenue seulement par la pratique constante. Malgré un examen attentif de tous les aspects, certains rats ne parviennent pas à apprendre la tâche (Figure 2). Ces «non-apprenants», soit manquent de motivation résultant en quelques absents ou tentatives de récupération des granulés à partir du début de l'expérience ou perdent généralement intérêt à parvenir pour les pastilles menant à échoué continu tentatives. En revanche, certains animaux montrent un comportement agressif et plus motivés résultant en hâtive et se précipitèrent saisir tentatives qui conduisent à des échecs. Un troisième groupe d'apprenants infructueuses sont ces animaux qui commencent avec des taux de réussite élevés et ne font pas d'amélioration significative conduisant à stagner, voire diminué les courbes d'apprentissage.
Réussir l'apprentissage des habiletés motrices se compose de deux phases: Une composante d'apprentissage rapide représentant acquisition primaire habituellement observé au sein de la première journée de formation à moteur (à l'intérieur de session;
Pour analyser les performances lors de chaque (analyse intra-session) séance quotidienne, diviser le nombre total d'essais en 25 bacs d'essai (par exemple, 6 bacs pour 150 essais). Après l'expérience, calculer le pourcentage de granulés saisies avec succès pour chaque bac en divisant le nombre de succès dans la cellule respective par le nombre total d'essais sur le jour respectif.
Il doit être considéré que l'acquisition des habiletés motrices peut varier chez les animaux individuels. Différents rats ont besoin de différents nombres de jours pour atteindre le niveau du plateau. Ainsi, les courbes d'apprentissage individuels sont d'habitudement pas aussi lisse que la courbe d'apprentissage de la moyenne.
Une autre expression de la réussite de l'apprentissage moteur est l'analyse de l'amende apprentissage moteur à l'écoute. Pour évaluer cet aspect, nous avons mesuré le nombre de pastilles saisies sur la première tentative lors d'un mouvement monolithique sans hésitation ni perturbation en comparaison à tous les granulés mesurées avec succès (Figure 5).
Les exemples en Figure 2 - 5 montrent les courbes d'apprentissage de 150 saisies granulés / jour au cours des 6 jours. Jour 1 se réfère à la première journée de l'apprentissage moteur.
Figure 1: Conception de la boîte de formation de rat (A) La boîte de formation avec ses dimensions respectives.. Afin d'éviter l'extraction de pastilles qui ont été perdus à l'intérieur de la boîte, le sol de la chambre de formation est faite de tiges métalliques , À travers lequel perdu boulettes tombent. (B) Vue rapprochée de l'ouverture de fente et la poste. Notez la position du poste central aligné à l'ouverture de la fente. (C) Exemple de rat préhension avec succès une pastille à travers l'ouverture en forme de fente. Notez la position de poste décalé et l'angle résultant vers forelimb préféré de l'animal (dans ce cas, à droite). S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Exemple d'un animal qui ne présentent acquisition réussie de l'habileté motrice au cours de 6 jours Le taux de réussite stagne autour de 20%, sans aucune amélioration à la formation continue.
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Figure 3: l'analyse intra-jour de la même exemple comme le montre la figure 4. Le taux de réussite est divisé en 6 bacs de 25 pastilles illustrant l'amélioration de l'apprentissage moteur tout au long d'une seule séance par jour. Notez le taux de succès initial au cours des 25 premiers essais des 2 premiers jours en comparaison avec le taux de réussite moyen des jours respectifs de la figure 4, ainsi que l'amélioration générale dans les jours 1 et 2 par rapport à la figure 4.
Figure 4:. Exemple d'un animal avec un, succès courbe typique d'apprentissage au cours de 6 jours Le pourcentage de boulettes saisies succès (taux de réussite) augmente pendant les 3 premiers jours et atteint un plateau au cours des jours restants.
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Discussion
Le paradigme montré dans cette étude est adapté de Buitrago et al 18 et diffère de la simple pastille classique paradigme atteindre 17 principalement dans deux aspects.:
Tout d'abord, l'étude de l'amélioration au sein de session permet une analyse de la tâche appris en une seule journée, ce qui peut fournir un niveau de différentes informations telles que l'enquête de la composante d'apprentissage rapide par rapport à la composante d'apprentissage lent représenté par les valeurs quotidiennes moyennes (voir figures 3 et 4). Deuxièmement, le paradigme comportemental présenté ici augmente le degré de difficulté et la complexité de la tâche de l'habileté motrice. L'animal est forcé de réaligner son orientation du corps et atteindre avant chaque récupération de culot. Cela empêche l'exécution de mouvements répétitifs simples sous le même angle et nécessite une profonde orientation spatiale. En outre, les granulés sont récupérés à partir d'un montant vertical mince qui est placé en face de the cage et correspond au diamètre de la pastille qui exige une connaissance précise pour la récupération efficace et simple, la prévention de traction de la pastille en direction de l'animal.
Une étape importante est d'enseigner l'animal de courir à l'arrière de la cage et revenir à l'ouverture de la fente lors de la pré-formation. Laissant entendre le rat à l'endroit désiré en utilisant une pince et tapotant doucement sur le panneau arrière de la cage de l'animal aide à comprendre la tâche. L'expérimentateur devrait utiliser cet outil de soin que surexploitation produit trop de bruit et irrite l'animal. Une fois que le rat est revenue sur le devant de la cage, placez plusieurs pastilles de sucre à l'ouverture de la fente pour l'animal de se habituer avec le goût, l'odorat et l'emplacement de la pastille. Une autre étape importante est la récupération des granulés avec le membre antérieur sur le premier jour de l'apprentissage moteur. L'animal se poursuit souvent tentatives pour récupérer le culot avec la langue comme appris lors de la pré-formation. En utilisant une pince à porter doucement ee culot près de la bouche et la rétraction de la pastille de l'animal tandis que la consommation des tentatives d'animaux avec la langue impose le rat pour étirer la patte antérieure pour la réussite de la récupération de culot. L'objectif est de permettre à l'animal de saisir le culot de la pince à l'aide de la patte antérieure et récupérer le culot de sucre à son embouchure. Une fois que cela a été réalisé, des pastilles peuvent être placés à la détermination de la préférence poste et la patte peut être évaluée. Ces deux étapes sont les parties les plus importantes de toute l'expérience et requièrent une approche prudente de l'animal ainsi que la patience de l'expérimentateur.
Il est important de noter que les différences dans l'apprentissage existent entre les animaux et entre les sexes (mâles apprennent plus lentement que les femelles) et 18 souches (selon notre observation, des rats Sprague-Dawley utilisées dans cette étude et Long-Evans rats montrent supérieure par rapport à l'apprentissage par exemple, des rats Lewis). Ainsi, afin de répondre à la difficile exigentments de la tâche, les taux de réussite peuvent nécessiter des modifications du paradigme en fonction du sexe et de la souche. Pour garder la variance faible, ne pas mélanger les souches et de l'égalité dans une série expérimentale.
Bien structurés et paradigmes comportementaux contrôlables sont d'une importance cruciale pour les études portant sur les corrélats cellulaires mécanismes du comportement pathologique et physiologique sous-jacents. Les tâches de comportement plus complexes que les rats sont capables d'apprendre représentent un avantage important par rapport aux souris de rat. Les progrès continus dans les technologies pour les manipulations génétiques chez le rat permettront dans un avenir très proche pour mener des expériences sur des rats qui étaient jusqu'ici seulement possible chez la souris 19-21. En combinaison avec de nouvelles technologies d'imagerie et de techniques permettant la manipulation ciblée des circuits neuronaux, paradigmes comportementaux chez les rats peuvent ouvrir de nouvelles voies vers la compréhension des principes physiologiques et pathologiques de fonctions du système nerveux.
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Acknowledgments
Ce travail a été financé par des subventions de la National Science Foundation suisse (Grant 31003A-149315-1 au MES et Grant IZK0Z3-150809 à AZ), à la Fondation AZ Heidi Demetriades, au MES le Conseil européen de la recherche ('Nogorise') et le Christopher Reeve Foundation et Dana (CDRF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Training box | Self Made | ||
| Pedestal | Self Made | ||
| Sugar pellets | TSE Systems Intl. Group | 45 mg dustless precision pellets | |
| Sprague Dawley rats | 5-6 week old males | ||
| Laptop computer | Hewlett Packard | ||
| Stop Watch | |||
| Forceps | Fine Science Tools (FST) | ||
| Excel | Microsoft | ||
| Prism | GraphPad | ||
| Weighing scale | |||
| Counter |
References
- Fu, M., Yu, X., Lu, J., Zuo, Y. Repetitive motor learning induces coordinated formation of clustered dendritic spines in vivo. Nature. 483, 92-95 (2012).
- Fu, M., Zuo, Y.
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
- Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462, 915-919 (2009).
- Yu, X., Zuo, Y.
- Rioult-Pedotti, M. S., Friedman, D., Donoghue, J. P. Learning-induced LTP in neocortex. Science. 290, 533-536 (2000).
- Rioult-Pedotti, M. S., Friedman, D., Hess, G., Donoghue, J. P. Strengthening of horizontal cortical connections following skill learning. Nature neuroscience. 1, 230-234 (1998).
- Rioult-Pedotti, M. S., Donoghue, J. P., Dunaevsky, A.
- Fritsch, B., et al. Direct current stimulation promotes BDNF-dependent synaptic plasticity: potential implications for motor learning. Neuron. 66, 198-204 (2010).
- Ghiani, C. A., Ying, Z., de Vellis, J., Gomez-Pinilla, F. Exercise decreases myelin-associated glycoprotein expression in the spinal cord and positively modulates neuronal growth. Glia. 55, 966-975 (2007).
- Josephson, A., et al. Activity-induced and developmental downregulation of the Nogo receptor. Cell and tissue research. 311, 333-342 (2003).
- Karlen, A., et al. Nogo receptor 1 regulates formation of lasting memories. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20476-20481 (2009).
- Kleim, J. A., Lussnig, E., Schwarz, E. R., Comery, T. A., Greenough, W. T. Synaptogenesis and Fos expression in the motor cortex of the adult rat after motor skill learning. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 4529-4535 (1996).
- Mironova, Y. A., Giger, R. J. Where no synapses go: gatekeepers of circuit remodeling and synaptic strength. Trends in neurosciences. 14, 7-23 (2013).
- Park, H., Poo, M. M. Neurotrophin regulation of neural circuit development and function. Nature reviews. Neuroscience. 14, 7-23 (2013).
- Zemmar, A., et al. Neutralization of Nogo-A enhances synaptic plasticity in the rodent motor cortex and improves motor learning in vivo. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 8685-8698 (2014).
- Whishaw, I. Q., Pellis, S. M. The structure of skilled forelimb reaching in the rat: a proximally driven movement with a single distal rotatory component. Behavioural brain research. 41, 49-59 (1990).
- Buitrago, M. M., Ringer, T., Schulz, J. B., Dichgans, J., Luft, A. R. Characterization of motor skill and instrumental learning time scales in a skilled reaching task in rat. Behavioural brain research. 155, 249-256 (2004).
- Geurts, A. M., et al. Knockout rats via embryo microinjection of zinc-finger nucleases. Science. 325, 433 (2009).
- Tews, B., et al. Synthetic microRNA-mediated downregulation of Nogo-A in transgenic rats reveals its role as regulator of synaptic plasticity and cognitive function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2013).
- Li, D., et al. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nature. 31, 681-683 (2013).
