Introduction
Melk is de enige bron van voeding voor pasgeboren zoogdieren, het verstrekken van energie en voedingsstoffen voor de baby groei en ontwikkeling 1,2. Terwijl melk bestaat voornamelijk uit cellen, lipiden en eiwitten 1, bevat het ook een overvloed van bioactieve verbindingen die vroege leven ontwikkeling van nageslacht waaronder enzymen, koolhydraten, hormonen, antilichamen, groeifactoren, cytokines, exosomes, microvesicles en kleine RNA dergelijke moduleren als microRNA 1,2. De fundamentele rol van de moedermelk in de oprichting van de nakomelingen het immuunsysteem en de gezondheid van de darmen 3, in combinatie met het bewijs dat borstgevoede baby's zijn minder vatbaar voor ziekten 2, benadrukt het belang van de identificatie van de bestanddelen van melk in verband met de ziekte van processen in het begin van het leven en de moleculaire mechanismen die betrokken zijn in hun acties. De ontwikkeling van rat is een populair model voor het onderzoeken van het effect van verschillende voedings-, fysiologische en chemische interventies vroege-life ontwikkeling 4. De analyse van de rat melk kan daarom bieden nieuwe inzicht in de moeder en nakomelingen gezondheid.
De huidige wetenschappelijke vooruitgang bieden nu meer mogelijkheden voor diepgaand onderzoek naar de effecten van specifieke melkbestanddelen op gezondheid en ziekte. Zo heeft sequentiebepaling melk bacteriële profielen hun rol toegelicht begin darmflora van de baby darm 5, hebben massaspectrometrie analyse melk oligosacchariden inzicht gegeven in de wijziging van melk oligosaccharide profielen via maternale voeding 6 en diepe sequencing van microRNA uitgescheiden in de vetbolletjes moedermelk belicht mogelijke rollen in gentranscriptie, het metabolisme en het immuunsysteem 7.
Ratmodellen vertegenwoordigen een van de meest populaire modelorganismen gebruikt maternale studies 8,9. Een voordeel is hun korte zwangerschap en borstvoeding periode, van slechts approximatEly 21 dagen elk; dus de totale tijd vanaf het begin van de zwangerschap tot borstvoeding is een korte tijdsperiode waarin waardevolle data kunnen worden gegenereerd. De grotere omvang van ratten in vergelijking met muizen in het kader van melk verzamelen, kan een significant voordeel opleveren met betrekking tot hoeveelheid melk en gemakkelijk melkinzameling; melkproductie in de muis, lijkt bijvoorbeeld afhankelijk totale lichaamsgewicht zwaardere muizen produceren meer melk 10 te zijn.
Hier wordt een algemene beschrijving voor het handmatig verzamelen van melk van zogende ratten verstrekt. Dit protocol vereist een minimale uitrusting, niet-invasief, goedkoop, en kan worden gebruikt om voldoende hoeveelheden melk te verzamelen voor verdere stroomafwaartse analyses. In het kort, is de dam verdoofd met isofluraan, melkafgifte wordt gestimuleerd door oxytocine, en de melk wordt verzameld in capillaire buisjes via handmatige uitdrukking van de melk. Tot slot, als twee belangrijke componenten van de melk zijn vet en eiwitten, een korte description schatten melkvetgehalte behulp creamatocrit afmetingen 11 en kwantificeren van totale eiwitconcentratie met behulp van een standaard eiwit assay wordt gepresenteerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol werd goedgekeurd door de Universiteit van Calgary Animal Care Comite en voldeden aan de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren.
1. Afzonderlijk Dam van Offspring
- Scheid de dam van haar nakomelingen gedurende ten minste 5 min voor het melken 12.
LET OP: De dam kan worden gemolken 5-6 uur na de scheiding 1,6,13, maar perioden van scheiding langer dan 4 uur kan melksamenstelling 14 veranderen. Terwijl de scheiding tijd lijkt geen melk collectie volume 12 invloed hebben, wordt geadviseerd dat een consequente scheiding moment van het onderzoek worden gehandhaafd. Melksamenstelling kan gedurende de lactatie 15 te veranderen, dus pogingen moeten worden ondernomen om de dag van de melk collectie consistent te houden. Maximale melkproductie wordt voorgesteld om zich voordoen op het geven van borstvoeding dag 14 12. - Met behulp van een warming kamer, zorgen voor de pups in staat zijn om de juiste lichaam temperatu behoudenopnieuw zonder de aanwezigheid van de moeder voor de duur van het melken.
LET OP: In de studie hieronder weergegeven, melken werd uitgevoerd bij het spenen, wanneer de dammen waren ongeveer 22 weken oud en de jongen 21 dagen oud, dus geen opwarming kamer werd gebruikt.
2. Set-up en voorbereiding
- Verzamel alle materialen die nodig zijn voor het melken procedure.
LET OP: Alle materialen kunnen worden gevonden in de materialen en apparatuur tafel. - Plaats een verwarmingselement op de bank, waar melken zal plaatsvinden en betrekking hebben op de pad met een absorberend bankje onder-pad.
- Het opzetten van de verdoving systeem. Zorg ervoor dat het systeem voldoende zuurstof en isofluraan voorafgaand aan begin. Bevestig de verdoving masker dat wordt gebruikt voor de initiële anesthesie inductie naar de machine. Plaats het masker dat wordt gebruikt voor anesthesie onderhoud omgeving indien anders dan de oorspronkelijke verdoving masker.
- Bevestig een 25 G naald naar een 1 ml spuit voor oxytocineinjectie met behulp van aseptische techniek.
- Zet de verwarming pad zodat moederlichaam temperatuur tijdens het melken wordt gehandhaafd. OPMERKING: Controleer de temperatuur van de verwarming pad om de pad te waarborgen niet te heet worden en brandwonden veroorzaken. Als alternatief gebruikt een warmtebron, zoals een verwarmde operatietafel, die kan worden ingesteld op een bepaalde temperatuur.
3. Verdoven de Dam behulp Isoflurane
- Open de zuurstoftank en zet de stroom naar 1 L (1000 cc) per min. Schakel de stroom van isofluraan en ingesteld op 5%. LET OP: Vermijd directe inademing van verdoving en accumulatie van verdoving dampen te voorkomen.
- Verdoven de dam.
- Schakel over naar het onderhoud masker indien nodig, het plaatsen van de dam liggende op het absorberende bank pad. Bevestig verdoving door een gebrek aan pedaal reflex.
- Verminder de stroom van isofluraan 2-3% voor het onderhoud van anesthesie. Voortdurend toezicht dam gedurende de procedure om ervoor te zorgen depression van de ademhaling niet optreedt. OPMERKING: Eenmaal onder narcose, moet de ogen van de dam worden beveiligd met behulp van een steriele oog smeermiddel om te voorkomen dat de ogen tegen uitdrogen of gekrast.
4. Oxytocine Injection
- Zorg ervoor dat de oxytocine (20 USP eenheden / ml) is niet voorbij de vervaldatum. Ontsmet de flacon van oxytocine met een steriel alcoholdoekje / alcohol reiniging pad.
- Met behulp van aseptische techniek, het opstellen van 2 IE (0,1 ml) van oxytocine in de spuit. Gebruik een nieuwe naald en spuit voor elke dam die zal worden gemolken.
OPMERKING: Oxytocin doses variëren in het algemeen uit één injectie van 1 tot 5 IU 1,6,12,16. Als alternatief kan een dosering van 4 IU / kg lichaamsgewicht worden gebruikt 12. Een enkelvoudige dosis van 2 IE eenmaal worden herhaald wanneer moeilijkheden melken optreedt. - Injecteer de oxytocine intraperitoneaal. Steek de naald in de rechter kwadrant van de buik met de naald wijst naar het hoofd, schuinvan 15-30 °, ongeveer 0,5 cm diep.
- Trek de zuiger om negatieve druk voorafgaand aan de injectie te garanderen. Als een vloeistof (bloed, urine, darminhoud, etc.) wordt opgezogen in de spuit, verwijder de naald en probeer de injectie met een nieuwe naald en spuit. Als er geen vloeistof wordt opgezogen injecteer de oxytocine en de naald en spuit gooi onmiddellijk in een biohazard container.
- Wacht ongeveer 5-15 minuten voor de oxytocine melk teleurstelling te stimuleren.
5. Voorbereiding van de melken sites
- Kies de sites / spenen die melk zal worden verzameld. Melk kan worden verzameld uit elke speen 12.
- Verwijder voorzichtig de vacht rond de spenen worden gemolken met de trimmers, zoals bont moeite met monstername kan veroorzaken door wicking van de melk. Wees lief - de huid rond de spenen is uiterst gevoelig en kunnen droog zijn en als zodanig is gevoelig voor krassen en scheuren.
- Sterilisatie van de speen iis niet noodzakelijk, maar eventueel reinigen van de speen met lauw water na de vacht wordt verwijderd. Bereid ten minste twee locaties als meer dan een site nodig kunnen zijn voor de melk collectie.
OPMERKING: Als de analyse van melk bevat microbiële profilering, kan de speen gebied sterilisatie met jodium 5 vereisen.
6. Melk Collection
- Knijp de basis van de speen, handmatig het verdrijven van de melk voor de collectie.
OPMERKING: Als de analyse van melk bevat microbiële profileren, moet de eerste paar druppels melk worden weggegooid. - Verzamel de druppels melk in een capillaire buis, het vullen van de capillaire buis. Capillaire buisjes die grotere hoeveelheden (bijvoorbeeld 50 pi) vergemakkelijken het proces tegemoet.
OPMERKING: Indien moeilijk melkverzameleenheid is aangetroffen, kan een tweede dosis oxytocine toegediend. Het wordt aanbevolen de dosis niet hoger zijn dan 4 IE totaal. - Verdeel de melk de capillaire buis in een steriele microcentrifugebuis vanaanraken van het uiteinde van de buis die werd gebruikt om melk te trekken uit de speen naar de zijkant van de microcentrifugebuis - observeert de melk uit het capillair getrokken via capillaire werking.
OPMERKING: 'blow out' de melk die niet in de buis wordt getrokken met behulp van een 18 G naald bevestigd aan een 1 ml spuit. - Voortdurend toezicht op de dam op tekenen van pijn of respiratoire depressie en stel de stroom van isofluraan dienovereenkomstig.
- Blijven om melk te verzamelen, zoals beschreven in deze sectie totdat voldoende melk heeft verzameld voor de gekozen analyse van melk. Voor de hieronder beschreven creamatocrit en eiwit concentratie bepaling, het verzamelen van 0,25 ml melk.
OPMERKING: Gebruik een andere melken site als melk afknapper vertraagt of de gekozen locatie niet voldoende melk te verdrijven. Een maximum van ongeveer 2,5 ml melk per dier kan worden tot 17, of tot 0,5 ml per speen. De auteurs bevelen aan dat de totale tijd onder narcose worden beperkt tot ongeveer 45-60 min, or 45 min van het melken. - Verzamel melk in een microhematocrit buis creamatocrit meting van verse melkmonsters, en sluit het uiteinde van de buis met klei kit. Label de microhematocrietmethode buis met de dam-ID en rechtop op te bergen het melkmonster.
- Wanneer het melken is voltooid, schakelt u de stroom van isofluraan en zuurstof. Verwijder het masker van de dam en blijven volgen dam tot wakker. Het wordt aanbevolen dat als niet volledig bewust, de dam moet worden op een absorberend bankje kussen geplaatst tijdens de herstelperiode, in plaats van direct op de kooi beddengoed, om te voorkomen dat het beddengoed van wordt opgezogen of krassen op de ogen van de dam tijdens het herstel.
OPMERKING: de dam onbeheerd verlaten totdat het voldoende bewustzijn heeft herwonnen aan borstbeen recumbancy handhaven. - Indien geen verdere analyse nodig, melk bevriezen bij -80 ° C. Anderen hebben voorgesteld dat de melk kan worden bewaard tot 3 uur bij 4 ° C of 5 maanden bij -20 ° C 18.
7. Creamatocrit Meting
- Schatten het vetgehalte in de melk door het berekenen van de melk creamatocrit (het percentage van de room in het melkmonster) 19.
OPMERKING: Metingen met moedermelk hebben aangetoond dat zowel vers of bevroren melk kan worden gebruikt voor een creamatocrit meting echter verse melk meer sterk gecorreleerd (r = 0,92 versus r = 0,90) met lipideconcentratie 11. Het gebruik van verse of bevroren melk voor creamatocrit metingen moeten consistent worden gehouden over de studie, als ontdooide melk wordt geassocieerd met een kleine afname in creamatocrit waarden 11. - Voor verse melk, het verzamelen van een monster van melk uit de speen in een microhematocrietmethode buis; Vul ten minste ¾ vol (ongeveer 15-20 pi). Als alternatief, trekken verse melk uit de verzamelde monster in het capillair na goed mengen. Verzegelen het einde met klei kit.
- Plaats de capillaire buis in de hematocriet spinner, met deafgedichte wijst naar buiten, zodat de centrifuge in balans.
- Begin de hematocriet draai (120 sec bij 13.700 xg).
OPMERKING: Spin tijd of snelheid kan veranderen, afhankelijk van het model van de centrifuge gebruikt. - Haal de buis uit de centrifuge na de spin is voltooid en voert de metingen voor de berekening van creamatocrit. Observeren de scheiding van het monster in een crème laag en een heldere laag.
- Meet en registreer de totale lengte van fluïdum in de buis en de lengte van het vet (room) laag behulp van beugels of een liniaal.
Opmerking: De creamatocrit wordt uitgedrukt als het percentage van de crèmelaag binnen het melkmonster 19, berekend als (lengte crèmelaag / totale kolomlengte melk) x 100 (Figuur 1A). Bereken vetconcentratie en energiewaarden van de creamatocrit meting als volgt: Vet concentratie (g / L) = (creamatocrit (%) - 0,59) /0.146 (Figuur 1B) 19; Energie waarde (kcAl / L) = 290 + (66,8 * creamatocrit (%) (Figuur 1C) 19.
8. Eiwit concentratiebepaling
- Met behulp van runderserumalbumine als standaard eiwit, vaststellen van totaal melkeiwit concentratie met een standaard- eiwitanalyse, zoals een Lowry eiwit assay 6.
OPMERKING: Verdunning van de melk noodzakelijk zijn voor melkeiwit metingen binnen de standaardcurve van de assay valt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Melk werd verzameld zoals beschreven spenen van Wistar dammen (ongeveer 22 weken oud, met een gewicht 350-400 g) die een controle verbruikt (AIN-93G, n = 5) hoog eiwitgehalte (40% caseïne wt / wt, n = 5) of hoge prebiotische vezels (21,6% w / w, 1: 1 verhouding van oligofructose en inuline, n = 4) voeding tijdens de zwangerschap en borstvoeding. De dosis oxytocine werd 2 IU. Melk werd verzameld met behulp van capillaire buisjes, en één buis werd gecentrifugeerd met een hematocriet spinner creamatocrit (figuur 1A), die vervolgens werd gebruikt voor het schatten vetconcentratie en energiewaarde volgens bepaling: Vet concentratie (g / L) = (creamatocrit (% ) -0,59) /0.146 (Figuur 1B); Energy waarde (kcal / L) = 290 + (66,8 * creamatocrit (%) (Figuur 1C) 19. Milk eiwitconcentratie werd bepaald met de Bio-Rad DC proteïne assay (figuur 2). Er waren geen verschillen in creamatocrit (p = 0,674), vet concentratie (p = 0,674), energetische waarde (p = 0,674), or eiwitconcentratie (p = 0,127) op basis van maternale voeding (one-way ANOVA).
Figuur 1. Melk creamatocrit, vet concentratie en energie waarde. Melkmonsters werden voeding tijdens de zwangerschap en borstvoeding verzameld op het spenen van Wistar dammen op Control (n = 5), High Protein (n = 5), of High Prebiotische Fibre (n = 4). Creamatocrit metingen (A) werden gebruikt om melkvet concentratie (B) en de energetische waarde (C) te berekenen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Totale melkeiwit concentratie. Melkmonsters waren collected op het spenen van Wistar dammen op Control (n = 5), High Protein (n = 5), of High Prebiotische Fibre (n = 4) voeding tijdens de zwangerschap en borstvoeding. Totaal eiwit concentratie werd bepaald met behulp van de Bio-Rad DC proteïne assay. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen. Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met CCAC goedgekeurde protocollen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door middel van subsidies van de Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada (RGPIN 238382-2011) en de Canadese Institutes of Health Research (MOP115076). Heather Paul werd ondersteund door een Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada Postgraduate Scholarship en een Alberta vernieuwt Health Solutions beurs. Megan Hallam werd ondersteund door een Natural Sciences and Engineering Research Council Postgraduate Scholarship, een Frederick Banting en Charles Best Canada Graduate Scholarship en een Alberta Children's Hospital Research Institute Training Award in Genetics, Child Development, en gezondheid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment - Milking | |||
| 1 ml syringes | BD-Canada | 309602 | |
| 25 G needles | BD-Canada | 305122 | |
| 18 G needles | BD-Canada | 305196 | |
| 50 μl Microdispenser Capillary Tubes | Fisher Scientific | 21-169D | |
| Oxytocin (20 USP Units/ml) | Bimeda-MTC | 1OXY015 | |
| PPC Vet Isoflurane Inhalation Anesthetic, 250 ml | Fresenius Kabi | M60302 | Used on the order of a veterinarian |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Dukal | 853 | |
| Absorbent Bench Underpad | VWR | 82020-845 | |
| Maxi-Therm Hyper/Hypothermia Blanket | Cincinnati Sub-Zero | 274 | |
| Rodent Anesthesia Machine with Vaporizer | Benson Medical Industries Inc. | Subject to individual laboratory needs | |
| Animal Masks | Benson Medical Industries Inc. | 50100/50102 | |
| Microcentrifuge Tubes | Axygen | MCT-060-C | |
| ChroMini Professional Trimmer | Wahl | ||
| Equipment - Creamatocrit | |||
| StatSpin SafeCrit Plastic Microhematocrit Tubes (Untreated) | Fisher Scientific | 22-274-914 | |
| Critoseal Capillary Tube Sealant Tray | VWR | 470161-478 | |
| StatSpin CritSpin Microhematocrit Centrifuge | Beckman Coulter, Inc | X00-004999-001 |
References
- Izumi, H., Kosaka, N., Shimizu, T., Sekine, K., Ochiya, T., Takase, M. Time-dependent expression profiles of microRNAs and mRNAs in rat milk whey. PLoS ONE. 9 (2), e0088843 (2014).
- Hsieh, C. C., Hernández-Ledesma, B., Fernández-Tomé, S., Weinborn, V., Barile, D., de Moura Bell, J. M. Milk Proteins, Peptides, and Oligosaccharides: Effects against the 21st Century Disorders. BioMed Res. Int. , (2015).
- Rogier, E. W., et al. Lessons from mother: Long-term impact of antibodies in breast milk on the gut microbiota and intestinal immune system of breastfed offspring. Gut Microbes. 5 (5), 663-668 (2014).
- Keen, C. L., Lönnerdal, B., Clegg, M., Hurley, L. S. Developmental changes in composition of rat milk: trace elements, minerals, protein, carbohydrate and fat. J. of Nutr. 111 (2), 226-236 (1981).
- Cabrera-Rubio, R., Collado, M. C., Laitinen, K., Salminen, S., Isolauri, E., Mira, A. The human milk microbiome changes over lactation and is shaped by maternal weight and mode of delivery. Am. J. Clin. Nutr. 96 (3), 544-551 (2012).
- Hallam, M. C., Barile, D., Meyrand, M., German, J. B., Reimer, R. A. Maternal high-protein or high-prebiotic-fiber diets affect maternal milk composition and gut microbiota in rat dams and their offspring. Obesity. 22 (11), 2344-2351 (2014).
- Munch, E. M., et al. Transcriptome Profiling of microRNA by Next-Gen Deep Sequencing Reveals Known and Novel miRNA Species in the Lipid Fraction of Human Breast Milk. PLoS ONE. 8 (2), e50564 (2013).
- Li, M., Sloboda, D. M., Vickers, M. H. Maternal obesity and developmental programming of metabolic disorders in offspring: Evidence from animal models. Exp Diabetes Res. 2011, (2011).
- Ellis, P. J. I., et al. Thrifty metabolic programming in rats is induced by both maternal undernutrition and postnatal leptin treatment, but masked in the presence of both: implications for models of developmental programming. BMC Genomics. 15, 49 (2014).
- Gomez-Gallago, C., et al. A method to collect high volumes of milk from mice (Mus musculus). An. Vet. Murcia. 29, 55-61 (2013).
- Wang, C. D., Chu, P. S., Mellen, B. G., Shenai, J. P. Creamatocrit and the nutrient composition of human milk. J. Perinatol. 19 (5), 343-346 (1999).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab. Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- Godbole, V. Y., Grundleger, M. L. Composition of rat milk from day 5 to 20 of lactation and milk intake of lean and preobese zucker pups. J. Nutr. 111 (3), 480-487 (1981).
- Del Prado, M., Delgado, G., Villalpando, S. Maternal lipid intake during pregnancy and lactation alters milk composition and production and litter growth in rats. J. Nutr. 127 (3), 458-462 (1997).
- Nicholas, K. R., Hartmann, P. E. Milk secretion in the rat: progressive changes in milk composition during lactation and weaning and the effect of diet. Comp. Biochem. Physiol. A. Comp. Physiol. 98 (3-4), 533-542 (1991).
- Azara, C. R. P., et al. Ethanol intake during lactation alters milk nutrient composition and growth and mineral status of rat pups. Biol. Res. 41 (3), 317-330 (2008).
- Keen, C. L., Lönnerdal, B., Sloan, M. V., Hurley, L. S. Effects of milking procedure on rat milk composition. Physiol. Behav. 24 (3), 613-615 (1980).
- Romeu-Nadal, M., Castellote, A. I., Lòpez-Sabater, M. C. Effect of cold storage on vitamins C and E and fatty acids in human milk. Food Chem. 106 (1), 65-70 (2008).
- Lucas, A., Gibbs, J. A., Lyster, R. L., Baum, J. D. Creamatocrit: simple clinical technique for estimating fat concentration and energy value of human milk. Br. Med. J. 1 (6119), 1018-1020 (1978).
- Furtado, K., Andrade, F. Comparison of the beneficial and adverse effects of inhalable and injectable anaesthetics in animal models: a mini-review. OA Anaesthetics. 1 (2), 20 (2013).
- Hausman Kedem, M., et al. The effect of advanced maternal age upon human milk fat content. Breastfeed. Med. 8 (1), 116-119 (2013).
- Mandel, D., Lubetzky, R., Dollberg, S., Barak, S., Mimouni, F. B. Fat and energy contents of expressed human breast milk in prolonged lactation. Pediatrics. 116 (3), e432-e435 (2005).
