Il monitoraggio ottico di Living nervo terminale Etichettatura nel follicolo pilifero lanceolate Endings del Ex Vivo Mouse Ear pelle

Terminazioni nervose meccanosensoriali sono tipicamente piccole, diffusamente distribuita e di difficile accesso in situ, in quanto sono di solito sepolti in profondità nella pelle o altri tessuti circostanti. Loro visualizzazione, di conseguenza, di solito richiede sezionamento seguito da un prolungato immunomarcatura / periodo di colorazione, o il ritardo e la spesa di ottenere linee del mouse con l'espressione genetica di etichette fluorescenti come la proteina fluorescente verde o giallo (GFP / YFP) ^1. Qui vi mostriamo un tessuto comodo e un metodo rapido e semplice per ottenere l'accesso a un gran numero di afferenti follicolo pilifero per lo studio, e come possono essere rapidamente etichettato per il controllo ottico della funzione del terminale ^2. Con la pratica, l'intera tecnica da dissezione all'imaging può essere completato in meno di 2 ore.

I terminali lanceolate di assoni sensitivi che innervano i follicoli piliferi nei mammiferi formano palizzate intorno l'epitelio dei capelli-follicolo, con ogniterminale inserita tra gliali cellule / Schwann processi di ^2-4. Lo scopo dei morsetti è per rivelare lo spostamento meccanico dei peli che circondano. Essi sono una miscela di terminazioni rapidamente e lentamente adattando, ma prevalentemente producono brevi sequenze di attività in risposta al movimento dei capelli. Tipicamente, la cottura ferma molto rapidamente quando il movimento cessa, anche in presenza di spostamento continuato.

Questo modello murino pinna per lo studio di terminali lanceolate con metodi ottici ha molte caratteristiche vantaggiose per studiare la struttura e la funzione di queste terminazioni. La pinna è prevalentemente due strati di pelle apposto back-to-back, con solo una piccola quantità di tessuto cartilagine tra. La pelle è molto sottile e facilmente sezionato causa di minime quantità di adesivo debolmente tessuto connettivo rispetto ad altre regioni del corpo. Gli strati di pelle facilmente separati, quindi, dare un buon accesso ai follicoli e terminali. l'innervazioneè facilmente accessibile e identificabile. I follicoli dei capelli sono più scarsamente distribuiti che in altre regioni della pelle, facilitando la formazione immagine di individui o piccoli gruppi di follicoli. Lo strato dermico sottostante sottile dà una buona accessibilità ai coloranti e droghe farmacologiche, quindi è l'ideale per l'imaging mediante microscopia a fluorescenza, senza ulteriori elaborazioni. La formazione immagine di terminali marcati può essere sia di terminali viventi o, se si utilizza un analogo tintura risolvibile, dopo la fissazione e il successivo trattamento istologico.

Abbiamo usato questa preparazione per dimostrare che la membrana di riciclaggio si verifica nelle terminazioni lanceolate, dimostra assorbimento (endocitosi) e il rilascio (esocitosi) di un colorante styryl piridinio (FM1-43; N - (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) piridinio dibromuro). Il colorante non, tuttavia, sembra etichettare in modo significativo i processi della cellula di Schwann investire ^2. Abbiamo anche dimostrato che questo colorante assorbimento / rilascio, e quindi membrana reCycling, è soggetto alla modulazione glutamatergica attraverso un atipico (fosfolipasi D-coupled) dei recettori metabotropici del glutammato. I risultati di semplici protocolli di stimolazione e di analisi sono illustrati, e potenziali problemi di analisi comuni sono state evidenziate anche.

Questi metodi sono stati utilizzati nella ricerca riportata in Banks, RW et al. ² I topi sono stati sacrificati umanamente per dislocazione cervicale. Nel Regno Unito, questo è un metodo legalmente approvato Schedule 1 riportate negli animali (Procedure Scientifiche) Act, 1986 e la direttiva europea 2010/63 / UE. Questa legislazione federale viene applicato localmente presso l'Università di Aberdeen da parte del benessere degli animali e etica Review Board che hanno approvato tutte le procedure.

1. Orecchie Preparazione per l'etichettatura

1. Preparare una soluzione salina fisiologica standard, ad esempio di Liley (1956) ⁵ e saturare con 90% O _2/5% CO ₂ (CarboGen). Salina di Liley è (mM): NaHCO ₃ (12), KCl (4), KH ₂ PO ₄ (1), NaCl (138,8), MgCl ₂ (1), CaCl ₂ (2) e glucosio (11). NOTA: Per tutto il resto di questo manoscritto, 'saline' farà riferimento alla soluzione salina che è completamente saturo di CarboGen. durante dissection, aggiornare la soluzione salina che copre la preparazione ogni 15 - 20 minuti.
2. Umanamente eutanasia un topo adulto senza danneggiare il cranio. NOTA: Abbiamo usato topi C57 / Bl6J e MF1, ma tutto lo sforzo del mouse può essere utilizzato. L'aspetto più importante è di non utilizzare grandi adulti (> 25 g). Etichettatura nei topi più grandi è meno affidabile, spesso in quanto limitato a piccoli e sparsi gruppi di follicoli.
3. Rimuovere le orecchie esterne (padiglioni auricolari) vicino alla base con ~ 25 cm forbici, appena sopra la linea pelo fitto, e immergere in soluzione salina in una gomma siliconica-foderato cultura / capsula di Petri (50 mm è di solito conveniente).
4. Posizionare la parte anteriore (concava) lato Pinna verso il basso e pin i margini per il silicone a intervalli regolari con perni sottili di insetti (~ 6 - 8 per orecchio, ~ pin 0,2 millimetri di diametro). Aggiorna saline ogni 15 - 20 minuti, o utilizzare un bagno in costante perfusione.
5. attenzione staccarsi la pelle posteriore dalla pelle anteriori per via smussa, inizialmente si accede dalla base del taglio della pinna soprala cartilagine centrale di spessore e lavorare in modo sistematico verso i sottili, margini esterni privi di cartilagine.
   1. Per fare questo, tenere il centro del bordo di taglio della pelle posteriori con un paio di n. 3 pinze. Poi, con le ganasce chiuse, posizionare i punti di un altro insieme di n. 3 pinze nel divario tra la pelle e la cartilagine sottostante.
   2. lavorare delicatamente i punti della pinza chiusa dal lato a lato all'interno della discontinuità, con la forza minima necessaria, allentare attentamente adesioni mentre peeling indietro la pelle posteriori per separare gli strati.
6. Con la pelle posteriore rimossa, lascia la pelle anteriori in posizione. Pin la pelle posteriore, lato dermico up, accanto alla pelle anteriore (come da 1.5, sopra).
7. Successivamente, con attenzione e rimuovere completamente la cartilagine pinna che è stato inserito tra gli strati di pelle dalla pelle anterior con la stessa tecnica smussa come in 1.6. Evita di fare fori di puntura con le pinze.
8. Poi, fo entrambe le preparazioni della pelle Pinna delicatamente buccia, grinta e strofinare via il sottile strato di tessuto connettivo, che assomiglia polistirene espanso, che copre le basi del follicolo pilifero. NOTA: Ottenere compensazione ottimale può prendere un po 'di pratica; rimozione del tessuto insufficiente ostacola l'accesso, sia per soluzione colorante e per l'imaging, mentre raschiando troppo energicamente rimuove le reti neurali che sono alla base dei follicoli.
9. Aggiornare la soluzione salina.

2. Lanceolate Terminal Labeling

NOTA: Il seguente protocollo è ottimizzato per la tintura styryl piridinio. Altri, chimicamente simili, coloranti piridinio stirilici dovrebbero lavorare, magari dopo qualche aggiustamento nella concentrazione e l'incubazione di tempo. Indossare guanti e un camice da laboratorio durante la manipolazione soluzioni coloranti. O comprare 10 mM soluzione madre di colorante direttamente dal produttore o preparare magazzino sciogliendo la polvere colorante in soluzione salina, senza glucosio. Aliquota (10 ml di solito è conveniente, ma regolare questo per grande scaLe sperimentazioni) e conservare congelati per un massimo di 6 mesi a -20 ° C o ~ 1 anno a -80 ° C. Polvere memorizzerà per almeno 2 anni. Evitare ripetuti di congelamento / scongelamento di soluzioni coloranti; questo denatura rapidamente il colorante. Una volta scongelato, conservare a 4 ° C ed utilizzare entro 1 settimana.

1. Pre-riscaldare un bagno d'acqua a 30 ° C, con una piattaforma ~ 3 - 5 mm al di sotto della superficie dell'acqua.
2. Appena preparare 10 mM soluzione colorante styryl piridinio (10 ml di appena scongelati 10 mM colorante styryl piridinio in 10 ml di soluzione fisiologica) ed equilibrare a bagnomaria.
3. Pin ciascun preparato in un silicone-rivestita in gomma 35 piastre di coltura mm sommerso in 1 - 2 mm di soluzione fisiologica (volume tipico, ~ 2 ml). Ogni preparazione della pelle Pinna produrrà due preparazioni, se tagliate a metà dal vertice alla base con piccole forbici (10 - lunghezza 15 cm), per ridurre al minimo l'uso degli animali.
4. Porre le capsule da 35 mm contenenti i preparativi Pinna saline ricoperte sulla piattaforma sommersa in C bagnomaria a 30 °. Assicurarsi che ilprofondità di acqua è sufficiente per il riscaldamento adeguata ma non contamini la soluzione salina nella vaschetta aperta.
5. Pin fine (0,5 - diametro esterno 1 mm) tubo con fluente O ₂ / CO ₂ nella base di silicone di ogni piatto a gas continuamente le preparazioni. posizionare anche in bagno d'acqua 100 ml di soluzione fisiologica priva di colorante per il lavaggio / piatto rinfrescante. Utilizzare una bottiglia tappata strettamente per mantenere la saturazione CarboGen e prevenire la contaminazione dell'acqua.
6. Equilibrare tutto a 30 ° C per 30 min quindi sostituire la soluzione salina nel corso dei preparativi Pinna da 100 ml bottiglia chiusa con tappo. Incubare altri 30 min. NOTA: Questa sostituzione compensa l'evaporazione salina e di eventuali perdite di volume di massa derivanti da gas-linea di bubbling.
7. Versare via fisiologica priva di tintura in un bicchiere da 100 ml di rifiuti, poi rapidamente e con attenzione macchia via eventuali residui di liquido intorno alla preparazione con la carta velina per minimizzare gli effetti di diluizione sul soluzione colorante da aggiungere successivo. Fare attenzione a non toccare (
8. Incubare preparazioni pinna in 2 - 3 ml di 10 mM colorante styryl piridinio per 40 min a 30 ° C e poi tornare a R / T per il resto della procedura.
9. Rimuovere non interiorizzato colorante in tre fasi, utilizzando soluzioni in R / T. NOTA: Questi passaggi sono meglio eseguite in luce minima ambiente (tende oscuranti, arancione illuminazione intensità rosso / basso) per iniziare occhio scuro-adattamento per l'imaging.
   1. Versare via la soluzione di etichettatura dai piatti in un bicchiere di rifiuti e lavare rapidamente in tre cambi di soluzione fisiologica priva di colorante in rapida successione. Ciò elimina la residua styryl piridinio soluzione colorante aderendo ai preparativi e qualsiasi colorante che departitions facilmente dalle membrane esposte.
   2. Incubare in una variazione finale di soluzione fisiologica priva di tintura per altri 30 min a departition colorante più restante dalle membrane di superficie, cioè non la tintura internalizzato dai terminali.
   3. Rimuovere colorante persistente bloccato to il foglietto esterno della membrana esposte da chelanti con solfonata b-ciclodestrina derivati ​​(Advasep-7, 1 mM, 5 min - vedi Tabella 1). Così, tutto colorante rimanente sarà all'interno dei tessuti.
10. Mettere in soluzione salina privo di coloranti fresca per l'imaging e asciugare l'esterno del piatto fondo con carta velina.
    NOTA: I terminali sono ora pronti per l'imaging. E 'importante essere consapevoli del fatto che le terminazioni lanceolate sono vivi e, di conseguenza, rilasciando lentamente il colorante piridinio styryl endocitosi di nuovo. Anche se questo sarà più lento a R / T, è importante ridurre al minimo i ritardi prima / durante l'imaging. Se l'esperimento richiede etichettatura dei più preparati, inizialmente mantenerle tutte non marcato a 30 ° C. Saranno valida per diverse ore. Poi etichetta in sequenza a intervalli, etichettando la seconda preparazione (passi 2.7 - 2.8.3), mentre l'imaging del primo.

3. Imaging etichetta Lanceolate Endings.

NOTA: L'osservatoredovrebbe essere adattata al buio per le seguenti operazioni di imaging. La maggiore acuità visiva questo permette significa livelli di luce inferiori di eccitazione sono necessari per trovare i follicoli per l'imaging. Questo è più importante per minimizzare fototossicità invece di ridurre l'inconveniente di photobleaching. I radicali liberi generati dai illuminazione piena intensità possono rapidamente (entro 60 sec) uccidere terminazioni nervose (GS Bewick, S. Fadul e WJ Betz, osservazioni non pubblicate) vivere.

1. Prima di imaging, controllare la preparazione allo stereomicroscopio dissezione e rimuovere con cautela eventuali detriti di superficie. Questo impedisce autofluorescenza contaminare le immagini.
   1. Montare il piatto sul palco di un microscopio a epifluorescenza in posizione verticale con un set di filtri fluoresceina standard (480-488 nm di eccitazione, 500-520 nm di emissione per tintura piridinio styryl).
2. Attenuare l'intensità della luce di eccitazione con filtri a densità neutra fino appena sufficiente a localizzare comodamente terminaleS.
3. Individuare follicoli etichettati osservando con bassa (3.5x - 4x obiettivo secco), poi progressivamente obiettivi più elevato (obiettivo ad immersione 10x e 20x acqua) ingrandimento.
4. Catturare immagini di terminali lanceolate etichettati con obiettivo 10x a secco per bassa potenza e 20x obiettivi immersione acqua per ingrandimento maggiore. Ridurre al minimo l'intensità e il tempo di esposizione della luce (un tempo di integrazione della fotocamera di 0,5 - 1 sec è suggerito).
5. Catturare immagini su una fotocamera digitale standard e salvare le immagini sul disco rigido del computer utilizzando il software proprietario. NOTA: Un tipico esempio è mostrato in Figura 1.
6. Immagine ~ 20 terminazioni lanceolate da ogni preparazione. Iniziare la più margine dal bordo tagliato alla base della pelle pinna e lavoro lungo questo margine di imaging ogni follicolo a turno. Lavorare attraverso leggermente sovrapposte campi parallelamente al bordo di taglio, facendo attenzione a non immagine stessa follicolo due volte e quelli che sono ovviamente danneggiati. NOTA: Ilre sono in genere troppo molti terminali lanceolate di immagine a tutti prima che si verifichi significativo spontanea de-colorazione. Così, si consiglia sistematicamente campionamento della popolazione che utilizza il seguente protocollo.
7. Dopo aver completato la striscia marginale, spostare un campo a larghezza verso la base della pinna, e ripetere il processo in senso inverso.
8. Immagine tutti i terminali incontrati, ad eccezione di quelli occasionali chiaramente orientati molto più obliquamente rispetto al piano ottico e improbabile per adattarsi completamente all'interno dell'analisi anulare ROI standard (vedi paragrafo 4). Non escludere lanceolates insolitamente forte o più debole rispetto ai terminali circostanti, a meno che non sono ovviamente danneggiati o intensità sfondo è particolarmente elevato, indicando danni ai tessuti localizzati.
9. Eliminare la preparazione se più del 10% della superficie cutanea / morsetti sono danneggiati / inutilizzabile. NOTA: Come lanceolates Decolorare con il tempo, completa di imaging ciascun preparato entro 20 minuti dalla fine del lavaggio.
10. iof utilizzando più di una preparazione, assicurano i confronti intensità sono validi per le preparazioni di tempo-matching. Per fare questo, compensato tempi di colorazione ogni preparazione da ~ 30 minuti, al fine di garantire la comparabilità dei tempi di de-macchia.
11. Per monitorare de-macchia (esocitosi), l'immagine lo stesso terminale a 5 o 10 min intervalli. Con la pratica, è possibile immagine fino a 3 terminali separati per ogni punto temporale in qualsiasi preparazione.

4. Analisi etichetta Lanceolate Endings.

Nota: La seguente procedura è un metodo rapido per l'analisi intensità terminale.

1. Effettuare una regione anulare di interesse (ROI) centrata sulla punta del fusto del capello alla base del follicolo (Figura 2). Impostare la circonferenza interna della ROI anulare sufficientemente elevato per evitare il fusto del capello auto-fluorescenza in ogni follicolo da analizzare ma ancora comprendere tutti la fluorescenza terminale. Assicurarsi che la circonferenza esterna è abbastanza grande da racchiudere il più grande terminAl che si possono verificare, che è orientata vicino all'asse ottico / follicolo principale.
2. Realizzare uno sfondo ROI approssimativamente uguale nella zona a corona circolare di destinazione (quadrato o un cerchio, tipicamente ~ 400 micron ²⁾ per determinare l'intensità di colorazione locale in prossimità del terminale in analisi.
   Nota: Le dimensioni di queste due ROI sono impostati all'inizio dell'analisi e utilizzati per analizzare tutti i successivi follicoli / terminali lanceolate in tutti i preparati in qualsiasi esperimento. Quindi, è importante impostare i parametri con cura all'inizio.
3. Posizionare il ROI di fondo abbastanza vicino al follicolo di rappresentare sfondo locali nelle ghiandole sebacee che sono alla base dei terminali, non la pelle minore intensità tra i follicoli, ma attenzione a non includere le regioni terminali.
4. Registrare l'intensità media delle due ROI utilizzando la 'misura' o 'analizzare il ROI' funzione del software e di trasferire dati a un foglio di calcolo.
5. Nel foglio di calcolo, per ogni singolo follicolo sottrarre l'intensità media di fondo locale da che l'anello di dare una intensità netta. Questa regolazione per il fondo localizzata riduce notevolmente la variabilità tra-follicolo.

I follicoli piliferi in questa preparazione pinna sono facilmente visibili con transilluminazione senza fluorescenza (Figura 1A), illustra la natura sottilissimo del preparato e la relativa facilità di accessibilità si permette a questi terminali meccanosensoriali. Ogni è caratterizzata dalla base fusto del capello prominente perforando la falce scura della ghiandola sebacea. Sotto epifluorescenza, i terminali lanceolate etichettati circondano ogni follicolo pilifero si vedono chiaramente e mostrano il solito robusto spontanea colorante styryl assorbimento (Figura 1B). Questo avviene senza movimento imposto. I terminali lanceolate sono visti circondare il fusto del capello, anche se il grado di accerchiamento è variabile 6. Gran parte del dell'etichettatura è puntata (macchie), piuttosto che la disposizione lineare che ci si potrebbe aspettare. Il pattern puntiforme riflette terminali osservati in un piano ottico lungo la lunghezza del terminale. Thipreparazione s ricevuto alcuna ulteriore elaborazione per la visualizzazione dopo etichettatura, è stato semplicemente trasferito in una fase di microscopio e ripreso in situ, che illustra ancora una volta la semplicità di questa preparazione.

Esperimenti Esempio Per che questo romanzo preparazione è adatta sono mostrati in figura 3. Può essere usato per studiare sia endocitosi e esocitosi nei terminali di vita, così come la loro modulazione. Così, per endocitosi, agonisti dei recettori del glutammato può aumentare l'intensità di etichettatura, mentre il blocco di Ca 2+ canali con leganti o cationi come il Mg 2+, Ni 2+ o Cd 2+ diminuisce 2. In alternativa, questa preparazione può anche essere usato per studiare la cinetica di esocitosi, come mostrato in Figura 3C. Innanzitutto, un terminale marcato è visto de-colorazione spontaneamente. Tuttavia, questo Decolorare è accelerato dalla stimolante esocitosi, latrotoxin. più decode dei risultati sperimentali possono essere visti Banks, RW et al. 2.

Figura 1. robusta styryl Dye Etichettatura Registrato nel Pinna Mouse. (A), parte di una preparazione pinna senza etichetta nell'illuminazione campo luminoso, che mostra come chiaramente follicoli dei capelli appaiono nelle aree liquidati del sovrastante tessuto areolare / adiposi. I, di solito bilobato, forme a mezzaluna scure sono ghiandole sebacee che circondano il fusto del capello centrale. (B) Una zona simile, ad un ingrandimento leggermente superiore e ripreso con epifluorescenza, mostrando terminazioni lanceolate etichettati con la tintura styryl. Scala bar -. 40 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 2. Analisi di styryl Dye Labeling intensità. (A) modello circolare tipica di etichettatura follicolo pilifero con la tintura styryl, centrata sulla fusto del capello (non visibile in questa immagine). (B) 'regione di interesse' L'analisi principale (ROI) è definita da un anello di serie sovrapposta sulla posizione del palisade di terminazioni nervose lanceolate circondano il follicolo. Questo ROI viene mantenuta costante in forma e zona per ogni singolo esperimento per garantire intensità etichettatura può essere abbastanza confrontata tra preparativi e attraverso tutti i trattamenti. Intensità netta di ogni ROI è calcolato sottraendo l'intensità di una regione fondo quadrato o circolare adiacente (~ 400 micron 2). Di nuovo, questa regione fondo quadrato viene mantenuta costante in forma e l'area durante ogni esperimento.target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Etichettatura Intensità del follicolo dei capelli afferenti Lanceloate Endings non è normalmente distribuito, e può essere utilizzato per esaminare sia endo- ed esocitosi. Dati tipici provenienti da misure di intensità colorante styryl nei terminali lanceolate spontaneamente etichettati utilizzando il metodo di analisi descritto in precedenza. (A) Intensità di etichettatura in condizioni di controllo (54 follicoli, 4 spighe) e 1 mM glutammato (42 follicoli, 4 orecchie). I valori di intensità dei singoli terminazioni vengono visualizzati come trame dot cluster. Ogni punto rappresenta l'intensità di uno palisade terminale intorno un follicolo. Si noti che anche in condizioni di controllo un paio di punti di dati (follicoli) sono estremamente intense, mentre la maggior parte sono raggruppati a bassa intensità. Il primo punto in un particolare intenslità è tracciata al centro e successivi punti dati della stessa intensità sono tracciati progressivamente più lateralmente su entrambi i lati. Così, diffusione laterale rappresenta la frequenza dei follicoli di qualsiasi particolare intensità etichettatura. Le linee orizzontali rappresentano mediana interquartile ± 25%. Incubazione con 1 mM glutammato aumenta l'intensità mediana ~ 50% (*** P <0,001, Mann-Whitney), ma etichettatura può essere migliorata dopo 200 - 300% in alcuni terminali. (B) che dimostrano glutammato-mediata migliorato dye assorbimento (endocitosi). Incubazione del preparato follicolo pilifero in glutammato (1 mM) aumenta marcatamente styryl colorante assorbimento, come mostrato dalla maggiore intensità etichettatura. barra della scala 20 micron. (C) Enhancing rilascio di colorante (esocitosi). Dopo l'etichettatura, tintura styryl viene spontaneamente rilasciato ancora una volta, come l'etichettatura a 0 min è chiaramente più luminoso a 60 minuti, anche dopo la sottrazione dello sfondo per il controllo per photobleaching. Questa release è notevolmente Potentiated da latrotoxin, una vedova nera ragno veleno costituente, che innesca incontrollato esocitosi delle vescicole. Dopo 60 min di tossina, l'etichettatura terminale è quasi impercettibile. Questa reversibilità di etichettatura tintura styryl supporta l'ipotesi che la fluorescenza del terminale è dovuta alla internalizzazione durante il riciclaggio locale delle vescicole sinaptiche-like. Barra della scala 20 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.