Ganglio spirale Neuron Espianto cultura e Elettrofisiologia su Multi Electrode Array

In accordo con l'Organizzazione Mondiale della Sanità, 360 milioni di persone in tutto il mondo soffrono di perdita dell'udito con profonde conseguenze sulla vita professionale e privata. Gli apparecchi acustici possono ripristinare la funzione sensoriale nelle forme moderate di perdita dell'udito; tuttavia, per i casi più gravi, l'opzione di trattamento più efficace è un dispositivo protesico chiamato impianto cocleare (CI). Gli IC contengono una serie lineare di elettrodi fino a 24 elettrodi, che viene inserita chirurgicamente nella scala timpanica della coclea. Gli elettrodi stimolano direttamente i neuroni gangliari a spirale, formando il nervo uditivo ¹.

Con più di 300.000 dispositivi impiantati in tutto il mondo, gli impianti medici sono impianti medici di grande successo e si collocano tra le procedure più convenienti mai riportate. Nonostante il suo successo, l'impianto cocleare presenta ancora dei limiti, come la risoluzione di frequenza ridotta rispetto all'udito fisiologico. Questo può portare a deficit di comunicazione efficace in gruppi o ambienti rumorosi e alla capacità di decifrare suoni molto complessi come la musica. Questa ridotta risoluzione della frequenza è probabilmente dovuta allo spazio tra gli elettrodi CI e i neuroni gangliari a spirale, che porta alla stimolazione di grandi gruppi di neuroni. Questo divario è nell'ordine delle centinaia di micrometri ^2,3. L'eliminazione di questo divario faciliterebbe la stimolazione di gruppi più piccoli di neuroni per elettrodo, aumentando così la risoluzione in frequenza e le prestazioni complessive del dispositivo ⁴.

Per studiare l'influenza del divario tra l'elettrodo e il neurone e l'effetto di vari protocolli di stimolazione ottimizzati, abbiamo sviluppato un saggio biologico in vitro basato su una caratterizzazione elettrofisiologica non invasiva degli SGN su array multielettrodi (MEA) ⁵. Inoltre, i MEA possono essere facilmente modificati per variare la forma, le dimensioni, il materiale e la rugosità superficiale dell'elettrodo, per ottimizzare l'interfaccia neurone-elettrodo. Quello che segue è un protocollo passo-passo per ottenere in modo riproducibile registrazioni da colture di neuroni gangliari spirali murini e valutare la dipendenza dai parametri sopra menzionati.

La cura degli animali e la sperimentazione è stata eseguita in conformità con le linee guida delle autorità locali svizzere (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons Berna, Svizzera).

1. Preparare Soluzioni per esperimenti

1. Preparare la soluzione di rivestimento matrice extracellulare (ECM) (vedi tabella Materiale, punto 6): mix Disgelo ECM sul ghiaccio. Diluire il mix ECM 1:10 in terreno di coltura di base (senza fattori neurotrofici o siero fetale bovino (FBS)) e memorizzare sul ghiaccio.
2. Preparare il terreno di coltura (vedi tabella Materiale, punto 1): Preparare uno stock di media Neurobasal non contenenti FBS o il cervello derived neurotrophic factor (BDNF). Supplemento supporti Neurobasal con FBS freschi (10%) e BDNF (5 ng / ml) appena prima di aggiungere alla coltura cellulare.
3. Preparare la soluzione extracellulare (vedi tabella Materiale, punto 2).

2. lavaggio e sterilizzazione di MEA

(Figura 1E). Ciascun elettrodo ha una dimensione di 40 x 40 micron ² con una spaziatura di 200 micron da centro a centro. Gli elettrodi sono fatti di platino. Gli elettrodi sono collegati ai corrispondenti contatti da un circuito in ossido di indio-stagno. Questo circuito è isolato da uno strato 5 micron di SU-8. Vedere la tabella Materiale per i dettagli sul fornitore. Altri layout MEA possono essere adatti per questi esperimenti.

1. Per i nuovi MEA: Sciacquare immergendolo in etanolo al 70% per 30 secondi e lavare con acqua distillata per 30 sec. Lavorare in una cappa a flusso laminare.
2. Lasciate asciugare MEA per 30 minuti in una cappa a flusso laminare.
3. Mettere ogni MEA in un individuo piastra di Petri sterile (35 mm x 10 mm) e sigillare con un foglio. Le MEA possono essere memorizzati fino al momento dell'utilizzo.
4. Per MEA usati: incubare le MEA in una capsula di Petri (35 mm x 10 mm) contenente 1 ml di soluzioni pe enzimaticalitio (vedi Materiali Tavolo, punto 6) O / N su agitatore orbitale a temperatura ambiente per rimuovere il materiale biologico. Quindi continuare come al punto 2.1.
   NOTA: Maneggiare le MEA con cura utilizzando una pinza con punte in gomma-coperto.

3. Preparazione di MEA per esperimenti di coltura

1. Rimuovere la lamina di sigillatura e lasciare il MEA nella scatola di Petri (35 mm x 10 mm) per l'intero esperimento.
2. Rivestire le MEA con la soluzione preparata al punto 1.1: Usare un raffreddore 200 microlitri punta della pipetta (conservato a -20 ° C) da Dispensare 50 ml di soluzione di rivestimento per ogni MEA, che copre l'intera area degli elettrodi.
3. Lasciare MEA a cappotto per 30 minuti a 1 ora a temperatura ambiente.
4. Rimuovere la soluzione di rivestimento con una pipetta. Applicare 100 ml di terreno di coltura supplementato con 10% FBS e 5 ng / ml BDNF e lasciarlo a temperatura ambiente fino a quando la placcatura del tessuto.
5. Mettere 2 piastre di Petri contenenti le MEA rivestiti in una grande capsula di Petri (94 mm x 16 mm) e aggiungere una terza piccola capsula di Petri contenente 1,5ml di tampone fosfato (PBS) per l'umidificazione.
   NOTA: L'aggiunta di una piccola capsula di Petri (passo 3,5) contenente PBS è fondamentale per ridurre in modo significativo l'evaporazione del terreno di coltura.

4. ganglio spirale Dissection

NOTA: la dissezione lordo può essere fatto al di fuori della cappa a flusso laminare (Passo da 4.1 a 4.4). Per le condizioni di sterilità multa dissezione (cappa a flusso laminare) sono obbligatori (dal punto 4.5).

1. Eutanasia degli animali (5-7 giorni di età topi) per decapitazione senza previa anestesia.
2. Sterilizzare la testa a spruzzo con il 70% di etanolo.
3. Mantenendo il capo, tagliare la connessione tra la pelle e il cranio con una forbice tagliente / tagliente lungo la linea sagittale.
4. Tagliare il cranio sagittalmente e rimuovere il cervello usando forbici affilate / smussato.
5. Tagliare le ossa temporali dal cranio e mettere quelli in una capsula di Petri contenente una soluzione salina bilanciata sterile ghiaccio freddo Hanks '(HBSS).
6. Usando una dissezionemicroscopio zione, sezionare la bolla timpanica utilizzando una pinza sottile e isolare l'orecchio interno.
7. Rimuovere l'osso della coclea, utilizzando una pinza sottile.
8. Rimuovere il legamento a spirale e stria vascularis (SV) insieme tenendo con una pinza la parte basale del ganglio spirale (SG) e la SV e rilassarsi lentamente la SV dalla base-to-apice
9. Isolare l'organo del Corti (OC), la SG e il modiolus (Figura 1A - C)
10. Separare il OC dalla SG e modiolus tenendo con una pinza la parte basale del SG e l'OC e rilassarsi lentamente la OC dalla base-a-apice.
11. Espianti laterali CUT (da 200 a 500 micron di diametro) dal ganglio spirale ancora attaccate al modiolus (Figura 1D) utilizzando una pinza e un micro bisturi.

5. Spirale Cultura ganglio Espianto su MEA

1. Inserire due espianti gangliari spirale prossimi agli elettrodi sulla MEA precedentemente preparato con 100 ml di terreno di coltura.
2. Inserire l'organo di Corti a circa 5 mm dalla superficie degli elettrodi.
3. Utilizzare pinze per appuntare gli espianti e l'organo del Corti sulla MEA, evitando di danneggiare il tessuto.
4. Posizionare i MEA attentamente nell'incubatrice e nella cultura a 37 ° C e 5% di CO _2. Il giorno successivo, ispezionare visivamente che gli espianti hanno attaccato al MEA.
   NOTA: Se espianti non hanno attaccato O / N, che raramente farlo nei prossimi giorni. The OC è posto adiacente alla cultura per il supporto trofico / neurotrofico.
5. Aggiungere 100 pl di mezzo di coltura contenente 10% FBS e BDNF giorno per 5 giorni consecutivi.
6. Il giorno 6 aggiungere 2 ml di terreno di coltura contenente il 10% FBS e 5 ng / ml BDNF e la cultura del tessuto per altri 13 giorni.

6. elettrofisiologiche registrazioni per indagare spontanea e degli elettrodi di stimolazione di attività dipendente

1. Lavare la cultura MEA con extracellulare cosìluzione preparata al punto 1.3, a temperatura ambiente.
2. Asciugare i contatti con un fazzoletto di carta e montare il MEA sulla configurazione MEA.
   NOTA: per mantenere la cultura umido durante il montaggio, aggiungere una piccola goccia di soluzione extracellulare alla cultura.
3. Aggiungere 300 pl di soluzione extracellulare ed attendere 10 minuti prima della registrazione, per consentire al sistema di stabilizzarsi.
4. Registra attività spontanea per 2 minuti da tutti gli elettrodi premendo sul pulsante Record del software / acquisire e identificare elettrodi di registrazione.
5. Stimolazione dell'elettrodo MEA: Selezionare l'ampiezza / durata / forma dello stimolo sul software appropriato e si applicano a più elettrodi consecutivamente come descritto ^13. Selezionare gli elettrodi basati su quelli che mostrano attività spontanea (come nel passaggio 6.4). Registra da tutti i restanti elettrodi.
6. Per escludere da stimolo, stimolare dal medesimo elettrodo 10 volte. Se la cultura risponde almeno 8 volte su 10, può essere assunta comerisposta positiva su elettrodo indotta stimolazione.
7. Per identificare il rumore di fondo, applicare Tetrodotoxina (TTX) alla cultureat una concentrazione di 1 micron, per bloccare i canali del sodio voltaggio-dipendenti e record per 2 min. Usare questo per eseguire il rilevamento picco (7.1 e 7.2).

Analisi 7. I dati

NOTA: L'analisi dei dati è stata precedentemente descritta in dettaglio in ⁶ e ^5. Per le specifiche sul software utilizzati in questo studio vedi Materiali Tavolo, punto 7.

1. Utilizzando il software appropriato rilevare l'attività spontanea per ogni elettrodo impiegando un rivelatore sulla base di deviazioni standard e una successiva discriminatore. Questa procedura è descritta in ^6. Attività appare transitori più veloce di tensione (<5 msec).
2. Scegli una soglia che si traduce in alcuna attività quando si analizza il TTX trattati samples.Adapt il valore soglia per ogni esperimento per discriminare tra falsi positivE e false rilevazioni negative.
3. Utilizzando un software appropriato osservare l'attività neuronale rilevata di ciascun elettrodo come diagramma raster secondo procedure standard (vedere la Figura 2A - C).
4. Determinare e visualizzare l'attività di rete totale sommando tutti gli eventi rilevati all'interno di una finestra scorrevole di 10 msec, spostato da passi di 1 msec.
5. Rilevare l'attività di stimolazione indotta visualizzando i dati non elaborati utilizzando il software di analisi appropriato. Identificare offline manualmente i singoli picchi. Picchi singoli appaiono transitori di tensione più veloce, che si verificano dopo l'artefatto stimolazione (freccia testa nella Figura 2E). Un esempio è mostrato nella Figura 2E.
6. A seconda del esperimento, analizzare il numero di elettrodi rispondenti, la soglia necessaria per ottenere una risposta, il numero di potenziali di azione per elettrodi e altri parametri di interesse ^5.

8. Tessuto Fissazione e Immunohistochemistry

NOTA: Il processo di colorazione distruggerà il MEA. Vedere la Tabella Materiale (punto 4) per i reagenti.

1. Subito dopo la registrazione lavare le culture con 37 ° C caldo PBS tre volte. Eliminare il PBS e applicare 4% paraformaldeide (PFA) (in PBS), preriscaldata a 37 ° C per 10 min.
   ATTENZIONE: PFA è tossico. Lavorare in una cappa chimica con una protezione adeguata e la soluzione di scarto secondo le linee guida.
2. Lavare le culture tre volte con PBS e bloccare con 2% di sieroalbumina bovina (BSA) in PBS (0,01% Triton-X100) per 2 ore.
3. Aggiungere il primo anticorpo (anti-βIII tubulina, anticorpo TUJ) diluito in PBS (2% BSA e 0,01% Triton-X100) e lasciare O / N a 4 ° C. Lavare la cultura tre volte con PBS.
   NOTA: Da ora in poi mantenere il campione al buio più spesso possibile per minimizzare sbiancamento dell'anticorpo fluorescenza marcata secondario.
4. Aggiungere l'anticorpo secondario, diluito in PBS (BSA un 2%d 0.01% Triton-X100) e incubare per 1 a 2 ore a RT. Per colorare i nuclei aggiungi 1: 10.000 DAPI (1 mg / ml di magazzino) per 10 minuti.
5. Lavare tre volte con PBS e montare i campioni all'indietro per sottili coprioggetto (24 x 50 mm ²⁾ con mezzo di montaggio (vedi Materiali Tavolo, punto 4). Immagine utilizzando un microscopio a fluorescenza con 5X e 20X di ingrandimento.

La figura 1 riassume la procedura per l'isolamento dei tessuti, la preparazione e la cultura su MEA. Noi mostriamo le fasi consecutive di dissezione dei tessuti per isolare il ganglio spirale (SG) da dell'epitelio sensoriale dell'organo del Corti (OC) e vascularis stria (SV) ed allegate legamento a spirale (Figura 1 A - C). Espianti gangliari spirale (3-4 in numero) vengono tagliati con micro-forbici dal ganglio come schematicamente illustrato in Figura 1D e immessi sul MEA (Figura 1E), sopra la zona occupata elettrodo (2,2 mm 2). La OC è posto in prossimità, al di fuori della superficie dell'elettrodo. La crescita della coltura può essere monitorata nel tempo (Figura 1G). Un diagramma schematico del protocollo è mostrato nella Figura 1F. attività elettrofisiologica può essere rilevato dopo 6 giorni di coltura, che aumentano con il tempo la cultura prolungato. we recommend valutare 18 culture giorno che producono numeri significativamente più elevati di elettrodi di registrazione rispetto ai punti temporali precedenti 5.

Figura 1. Preparazione coltura delle cellule. (A) appena sezionato del mouse orecchio interno. Bianco linea tratteggiata indica la posizione della coclea, linea tratteggiata nera indica la regione vestibolare. Dell'orecchio interno (B) del mouse dopo la rimozione del muro ossea cocleare. giri cocleari sono indicati da linee tratteggiate bianche. (C) La spirale ganglio (SG) e modiolus, l'organo del Corti (OC) e le vascularis stria (SV) e del legamento a spirale sono mostrati dopo la dissezione. (D) Schema di SG e OC dissezione e preparazione SG espianto {figure adattato da 5 con l'approvazione da parte dell'editore}. (E) Illustrazione del array multi elettrodi utilizzati in questo studio. Registrareelettrodi sono organizzati in una griglia rettangolare al centro e occupano un'area di 2,2 mm 2. elettrodi 4 terra e contatti laterali sono illustrati. (F) Schema del protocollo di coltura. Le registrazioni vengono effettuate a giorno 18. (G) immagini Rappresentante (immagini in campo chiaro) e schemi di espianti SG su MEA monitorato in cultura al giorno 1, 6 e 18 bar scala = 400 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande questa figura.

L'attività spontanea può essere rilevato sulla MEA e mostrato come una trama raster cui ogni riga della trama rappresenta un picco rilevato. Un esempio rappresentativo che mostra attività spontanea rilevata da più elettrodi (diversi colori nei grafici) è mostrato (Figura 2A, 2B, e 2C).

(Figura 2D), 5 elettrodi di rispondere (tracce rosse) ed elettrodi non rispondere (tracce blu) è mostrato nella Figura 2E. Per questi esperimenti un elettrodo è stato utilizzato per la stimolazione e tutti gli altri elettrodi per la registrazione. singoli potenziali d'azione sono apparsi 1 msec dopo l'artefatto stimolazione (freccia testa nera). Il MEA può essere immunostained al termine della procedura per valutare la copertura dei processi neuronali sull'area dell'elettrodo. L'elettrodo indicato in verde nella figura 2F è stato utilizzato per la stimolazione, e gli elettrodi indicati in rosso sono stati usati per registrare le risposte (figura 2E).

Figura 2. registrazioni di dati su MEA. (A </ Strong>) Tracce di registrazioni originali di sei su 63 elettrodi che mostrano attività spontanea. Plot (B) Raster dei sei elettrodi della figura 2a dopo il rilevamento picco. Ogni barra rappresenta un potenziale d'azione. (C) trama raster tra cui tutti gli elettrodi (come in A e B) L'attività è registrata da 63 elettrodi (canali numero 0-63) per 2 min. (D) Uno stimolo bifasico con durata complessiva di 80 msec ed ampiezza di 80 μA è stato utilizzato per la stimolazione della cultura da un elettrodo (E58 in Figura 2F). (E) Esempio rappresentativo di tracce di dati grezzi ottenuti dopo la stimolazione da elettrodo 58 che mostra i potenziali d'azione (tracce rosse) o senza risposte (tracce blu) dopo la stimolazione (nero punta di freccia). (F) cultura ganglio spirale sulla MEA immunostained per il marcatore neuronale TUJ (verde) alla fine dell'esperimento per visualizzare neuro la copertura finale della superficie dell'elettrodo {figure adattato da 5 con l'approvazione da parte dell'editore}. Elettrodo 58 utilizzato per la stimolazione è indicata in verde, elettrodi rispondenti sono indicati in rosso. Barra di scala = 50 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Infine, la messa a punto MEA permette di studiare eventuale modifica superficie dell'elettrodo che possono aumentare la sensibilità di registrazione. Due elettrodi MEA disponibili in commercio sono stati usati in questo studio con due diverse superfici platino: grigio platino (grigio Pt), costituito da un 150 nm strato spesso Pt (impedenza: 400 KΩ / 1 KHz) e nero Platino, (nero, Pt), ottenuto mediante deposizione elettrochimica di Pt al termine del processo di microfabbricazione (impedenza: 20 KΩ / 1 KHz). Vedere Materiali Tabella (punto 6) per i dettagli.

Figura 3. Confronto di grigio vs elettrodi Nero Pt. Due tipi di elettrodi (grigio e nero Pt) sono stati confrontati fianco a fianco con 12 culture MEA indipendenti, 6 per ogni tipo MEA. (A) Il numero totale di reelettrodi spondenti per esperimento è mostrato. (B) soglia di ampiezza di ottenere una risposta, misurato con 30-35 coppie di elettrodi indipendenti in 6 esperimenti indipendenti MEA è mostrato. I dati sono mostrati come media +/- SD. (Student t test p <0.001) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.