Utilizzando RNA-sequenziamento per rilevare Novel Splice varianti correlati alla resistenza ai farmaci in In Vitro modelli di cancro

Nonostante i notevoli progressi nel trattamento del cancro, la resistenza delle cellule maligne alla chemioterapia, sia intrinseco o acquisito in seguito ad esposizione al farmaco prolungata, è il motivo principale per il fallimento del trattamento in una vasta gamma di leucemie e tumori solidi ^1.

Al fine di delineare i meccanismi alla base della resistenza ai farmaci, in modelli in vitro di linee cellulari sono stati sviluppati da selezione graduale di cellule tumorali resistenti agli agenti chemioterapici. Questa procedura imita i regimi utilizzati nelle impostazioni cliniche e permette quindi a un'indagine approfondita dei meccanismi di resistenza rilevanti. Cellule resistenti che sopravvivono al trattamento sono poi distinti da cellule sensibili parentali utilizzando saggi di vitalità cellulare / citotossicità ^2. In profili di resistenza ai farmaci in vitro di cellule primarie hanno dimostrato di essere significativamente correlata alla risposta clinica alla chemioterapia ^3.

High-throughput cytotosaggi tossicità costituiscono un metodo conveniente per determinare la sensibilità ai farmaci in vitro. Qui, la vitalità delle cellule è valutata per esempio 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil tetrazolio bromide - MTT assay ^4, che si basa sulla conversione metabolica di alcuni substrati (cioè, sali di tetrazolio) in prodotti colorati, riflettendo così l'attività mitocondriale di cellule. In alternativa, il contenuto di proteina cellulare può essere quantificata usando il saggio ⁵ sulforodamina B (SRB). Qui, il numero di cellule vitali è proporzionale alla densità ottica (OD) misurata ad una lunghezza d'onda appropriata in uno spettrofotometro, senza bisogno di ampio e che richiede tempo procedure di conteggio delle cellule. L'inibizione della crescita indotto da un certo farmaco chemioterapico può essere calcolato sulla base del diametro esterno dei pozzetti in cui le cellule sono state trattate con un agente di prova e comparati con il diametro esterno di cellule di controllo non trattate. Una curva dose-risposta è obtained tracciando concentrazioni di farmaco rispetto a percentuali di cellule vitali relativi alle cellule di controllo. Infine, la sensibilità ai farmaci può essere riportato come la concentrazione che provoca il 50% di inibizione della crescita cellulare rispetto alle cellule non trattate (IC _50).

I meccanismi alla base della resistenza ai farmaci includono molte anomalie differenti, come alterazioni influenzano l'espressione genica dei determinanti di attività di droga e il metabolismo cellulare. Queste lesioni molecolari, tra cui le mutazioni, aberrazioni ad un trascrizionale e livello post-trascrizionale, nonché regolazione epigenetica disturbato spesso colpiscono geni coinvolti sia nel metabolismo dei farmaci o apoptosi ^6.

Alternative splicing pre-mRNA e la sua regolazione intricata hanno recentemente ricevuto una notevole attenzione come un romanzo entità che possono dettare la resistenza ai farmaci delle cellule tumorali ^7. Fino al 95% dei geni umani sono splicing alternativo in cellule normali mediante questostrettamente regolamentato processo che produce molte isoforme di proteine ​​differenti dallo stesso gene. Splicing alternativo è spesso liberalizzato nel cancro e diversi tumori sono caratterizzati da splicing alterato di un numero crescente di geni coinvolti nel metabolismo dei farmaci (ad esempio, deossicitidina chinasi, sintetasi foli, o proteine multifarmaco resistenza) ^6,8. Tuttavia, un'analisi completa dei profili di giunzione delle cellule resistenti ai farmaci è dolorosamente carente. Pertanto, è imperativo sviluppare metodi high throughput per analisi alternative splicing. Questo potrebbe aiutare a sviluppare approcci terapeutici più efficaci.

Durante l'ultimo decennio, il rapido sviluppo delle tecnologie di prossima generazione di sequenziamento (NGS) ha arricchito la ricerca biomedica con nuove informazioni sui meccanismi molecolari che regolano regolazione dell'espressione del genoma e il loro ruolo in vari processi biologici ^9. RNA-sequenziamento (RNA-Seq) è un potente sub-applicazionedi NGS nel campo della trascrittomica. Esso consente una profilazione genome-wide (qualitativamente e quantitativamente) dei modelli di espressione di migliaia di geni contemporaneamente e ben si adatta per la caratterizzazione di nuovi mRNA codificanti così come lungo l'RNA non codificante, miRNA, siRNA, e altri piccoli RNA classi (ad esempio, snRNA e Pirna) ^10,11.

RNA-Seq ha molti vantaggi rispetto alle tecnologie precedenti per la caratterizzazione del trascrittoma (ad esempio, Sanger sequenziamento e microarray di espressione). Essa non si basa su l'annotazione del genoma esistente, ha un livello di singolo nucleotide di risoluzione e ha una gamma dinamica più ampia per la stima livello di espressione. In breve, il flusso di lavoro sperimentale di base di esperimenti di RNA-Seq è costituito da poliadenilato trascrizione (mRNA) la selezione e la frammentazione, seguita da conversione in cDNA, di costruzione di biblioteche e sequenziamento profondo, infine, massicciamente paralleli ^12,13. A causa della rapida diminuzione della sequencincosti g Nel corso degli ultimi anni, l'RNA-Seq sta gradualmente sostituendo le altre tecnologie e sforzi significativi sono stati fatti per migliorare i protocolli di preparazione biblioteca. Per esempio, è ora possibile per conservare le informazioni filo di trascritti di mRNA segnando il secondo filone di cDNA con deossiuridina trifosfato (dUTP) e, prima di amplificazione PCR, digerire il filo segnato con uracile-DNA-glycosilase (UDG). Questo processo aumenta la precisione di annotazione genica e stima dei livelli di espressione ^14,15.

L'analisi e l'interpretazione dei dati di RNA-Seq richiedono pacchetti software di calcolo complesse e potenti e la trasformazione delle condutture bioinformatici ^16,17. In primo luogo, la cruda legge subiscono il controllo di qualità, eliminando artefatti tecnici e biologici e scartando (trimming) le sequenze che non raggiungono i requisiti di qualità rigorosi. Successivamente la legge per ogni campione sono mappati ad un genoma di riferimento e indicizzatoin gene-livello, esone livello o livello di trascrizione, per determinare l'abbondanza di ciascuna categoria. A seconda dell'applicazione, i dati ricercati sono poi calcolate attraverso modelli statistici per l'identificazione di espressione allele-specifica, splicing alternativo, fusioni geniche e polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) ^12. Infine, l'analisi differenziale sul livello selezionato (cioè, l'espressione genica o splicing alternativo) può essere utilizzata per confrontare campioni ottenuti in condizioni diverse.

Analisi splicing differenziale descrive le differenze di utilizzo del sito di splicing tra i due campioni. Un numero crescente di pacchetti software dedicati a questo scopo sono disponibili sulla base di diversi modelli statistici, le prestazioni e l'interfaccia utente ^18. Tra questi, Mats (Analisi multivariata di Trascrizione Splicing) emerge come uno strumento di calcolo liberamente disponibile e preciso sulla base di un quadro statistico Bayesiano e progettati per rilevare diffeeventi di splicing renziale da entrambi i dati RNA-Seq singoli o accoppiati end. Partendo dai file allineate (.bam), STUOIE in grado di rilevare tutti i principali tipi di eventi alternativi di splicing (exon skipping, alternativa 'sito di splicing alternativo, 5' 3 sito di splicing, esoni si escludono a vicenda e ritenzione di introni - anche vedi Figura 1).

Innanzitutto, identifica software legge che supportano un certo evento giunzione, per esempio esone skipping e le classifica in due tipi. "Inclusione legge" (per l'evento giunzione canonica) mappare all'interno del esone indagato e abbracciare le giunzioni tra quella specifica esone e le due esoni fiancheggianti a monte ea valle. "Skipping legge" (per l'evento di splicing alternativo) abbracciano la giunzione tra i due esoni fiancheggianti. Successivamente, MATS restituisce il livello di inclusione normalizzato per entrambi gli eventi canonici e alternativi e confronta i valori tra i campioni o condizioni. Infine, calcola P-value unnd false discovery rate (FDR) supponendo che la differenza nel rapporto variante di un gene tra due condizioni supera una soglia definita dall'utente per ciascun evento splicing ^19,34.

A seguito di analisi di splicing differenziale in combinazione con RNA-Seq, una vasta validazione sperimentale è giustificato al fine di identificare i candidati veri positivi gene ^18. Quantitative inversione trascritto-polymerase chain reaction (qRT-PCR) è il metodo più comunemente utilizzato e ottimale in validazione dei candidati ottenuti dalle analisi di RNA-Seq ^20. Lo scopo di questo lavoro è quello di fornire una solida metodologia per indagare Profili di droga splicing di resistenza legate nei tumori solidi e le neoplasie ematologiche. Il nostro approccio utilizza RNA-Seq-based trascrittoma profili dei modelli di linee cellulari selezionate di tumori resistenti ai farmaci in combinazione con un metodo di qRT-PCR stabilito per la validazione dei geni candidati coinvolti nella resistenza ai farmaci.

21,22 e il metotrexato (MTX) Subline resistente CEM / R30dm ^23. Anche se le attuali terapie a base di GC e MTX stabilire beneficio clinico in circa il 90% dei casi, la comparsa di GC-resistenza rappresenta ancora un problema irrisolto con un meccanismo molecolare chiaro. Per isolare sub-cloni GC-resistente, le cellule CEM-WT sono state coltivate in 1 micron dexametasone (Des) per 2 o 3 settimane. Subline MTX-resistente CEM / R30dm è stato sviluppato attraverso ripetuta a breve termine (24 ore) esposizione delle cellule CEM-WT a 30 micron MTX come mimica di protocolli clinici. È interessante notare che questa linea cellulare visualizzata anche una resistenza incrociata a Dex (risultati non pubblicati), per i quali il meccanismo non è del tutto chiaro.

Il tum solidoo il modello studiato in questo studio è adenocarcinoma del dotto pancreatico, noto per la sua straordinaria refrattarietà alla chemioterapia. A questo scopo, abbiamo selezionato linea Panc-1 cellula e la sua gemcitabina resistente sub-clone Panc-1R ottenuta mediante incubazione continuo con 1 pM del farmaco ^24. Qui si descrive un metodo per scoprire nuovi meccanismi alla base in vitro resistenza ai farmaci mediante la combinazione di tre protocolli: saggi di citotossicità colorimetrici per valutare la sensibilità ai farmaci nelle cellule leucemiche e cellule tumorali di tumori solidi, gasdotto RNA-Seq-based per identificare varianti di splicing nuovi legati alla la sensibilità ai farmaci / resistenza e RT-PCR e qRT-PCR per convalidare potenziali candidati.

1. Caratterizzazione di Profili di droga resistenza attraverso citotossicità Assays

1. Leucemico Cell Culture Linea
   1. Mantenere il T-cellule parentali ALL linea cellulare CCRF-CEM (CEM-WT) così come i suoi sublines resistenti ai farmaci, tra CEM / R30dm, CEM-R5 e CEM-C3, nel 25 cm ² in media 10 ml RPMI-1640 contenente 2.3 mM di acido folico supplementato con 10% siero fetale di vitello e di 100 unità / ml di penicillina G e 100 ug / ml di streptomicina.
   2. Cultura le cellule in atmosfera umidificata a 37 ° C in un incubatore CO ₂ 5%.
   3. Lasciare crescita cellulare a concentrazioni tra 2 - 3 x 10 ⁶ cellule / ml.
   4. Dividere le cellule due volte a settimana a una concentrazione iniziale di 0,3 x 10 ⁶ cellule / ml (ad esempio, se la concentrazione cellulare è di 3 x 10 ⁶ cellule / ml, trasferimento sospensione cellulare 1 ml in un pallone nuovo contenente 9 ml di mezzo fresco). Eliminare la cultura dopo 20 passaggi consecutivi.
   Cultura Linea pancreatico carcinoma a cellule
   NOTA: Mantenere la linea pancreatica cellule di carcinoma umano Panc-1 in 75 cm ² fiasche di coltura in 10 ml di mezzo DMEM con elevato glucosio e L-glutammina supplementato con 10% siero fetale bovino e 100 unità / ml di penicillina G e 100 ug / streptomicina ml . La variante resistente ai farmaci, Panc-1R, viene coltivato nello stesso terreno di coltura contenente 1 mM gemcitabina disciolti in acqua sterile. Ulteriori dettagli sono forniti in ^24.
   1. Coltivare le cellule a 37 ° C in un incubatore CO ₂ 5%.
   2. Dividere le celle ogni 2 - 3 giorni in un rapporto di 1: 5 quando le cellule raggiungere la confluenza di circa il 90%.
   3. Per dividere le celle, lavare il due volte con tampone fosfato (PBS), aggiungere 1 ml di tripsina / EDTA per 75 cm ² pallone di coltura e incubare a 37 ° C per 3 min.
   4. Aggiungere 9 ml di mezzo e raccogliere le cellule staccate in un tubo da 15 ml. Seed sospensione cellulare 2 ml in una nuova conta pallonevorazio 8 ml di mezzo. Eliminare la cultura dopo 20 passaggi consecutivi.
2. MTT Assay per cellule leucemiche
   1. Preparare in anticipo la soluzione MTT: sciogliere 500 mg di MTT formazan in 10 ml di PBS e mescolare (protetto dalla luce) con un agitatore magnetico per circa 1 ora. Sterilizzare la soluzione con un filtro di 0,22 micron. NOTA: La soluzione può essere conservato in aliquote da 10 ml a -20 ° C. Proteggere dalla luce diretta dopo lo scongelamento.
   2. Preparate in anticipo il isopropanolo acidificato: aggiungere 50 ml di 2 M HCl a 2,5 L di isopropanolo. NOTA: Conservare la soluzione per almeno un mese a temperatura ambiente prima dell'uso. Se l'isopropanolo non viene acidificata correttamente, potrebbe formare precipitati con il terreno e compromettere la lettura spettrofotometrica.
   3. Preparare un separato da 96 pozzetti a fondo piatto "giorno 0" (controllo) Piastra per garantire stima più accurata di inibizione della crescita: dedicare 3 a 6 pozzi per ogni linea cellulare, aggiungere 30 ml di crescitamedie e 120 ml di sospensione cellulare (8.000 celle) per ogni pozzetto e 150 ml di mezzo di crescita nei pozzetti corrispondenti a spazi (non le cellule). Procedere dal punto 1.3.9 al punto 1.3.13 di questa sezione per misurare la densità ottica (OD). NOTA: Ulteriori dettagli sono forniti in ^4.
   4. Preparare un piatto sperimentale a 96 pozzetti a fondo piatto: dedicare 30 pozzi a concentrazioni di farmaco (10 concentrazioni, ciascuna in triplice copia), 10 pozzi per controllare le cellule e 10 pozzi per controllare mezzo senza cellule (spazi) e preparare una gamma di diluizioni di droga di desametasone ( Dex) utilizzando Dimetilsolfossido come solvente.
      NOTA: Per le cellule CEM-WT la gamma di diluizione Dex è tra 2 micron e 0,97 nM. Per le cellule CEM / R30dm, CEM-R5 e CEM-C3 la gamma di diluizione Dex è compresa tra 640 micron e 0,33 nM.
   5. Aggiungere 30 ml di ogni diluizione Dex in un pozzo all'interno della piastra a 96 pozzetti. Assicurati di includere ogni concentrazione in un triplice copia.
   6. Aggiungere 30 ml di terreno di coltura per benes corrispondente alle cellule di controllo e 150 ml di mezzo di crescita nei pozzetti corrispondenti a spazi vuoti.
   7. Raccolto in crescita esponenziale cellule e risospendere a loro concentrazione ottimale di semina.
      NOTA: Per determinare concentrazioni ottimali di cellule di partenza, si raccomanda di valutare il profilo di crescita di ciascuna linea cellulare linea cellulare in una piastra a 96 pozzetti da semina cellule a diverse concentrazioni e misurare quotidianamente per almeno 4 giorni. Scegli una concentrazione di semina che impedisce la crescita eccessiva di cellule dopo 72 ore, in quanto questo influenzerà l'esperimento saturando i valori OD. Per CEM-WT, CEM-C5 e CEM-R5 la concentrazione ottimale di semina è di 8.000 cellule / pozzetto, mentre per CEM / R30dm è di 5.000 cellule / pozzetto.
   8. Aggiungere 120 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto contenente sia la soluzione farmaco o mezzo di crescita (pozzetti corrispondenti alle cellule di controllo). Riempire i pozzetti esterni vuoti della piastra con 150 microlitri di PBS per assicurare una buona umidità nella piastra e incubare thpiastre e per 72 ore a 37 ° C con 5% di CO ₂ in un incubatore di coltura cellulare.
   9. Aggiungere 15 ml di soluzione di MTT ad ogni pozzetto e agitare la piastra per 5 min con una piastra shaker fino ad un massimo di 900 frullati / min.
   10. Posizionare le piastre indietro a 37 ° C con 5% di CO ₂ in un incubatore di coltura cellulare e incubare per altri 4 - 6 ore.
   11. Aggiungere 150 ml di isopropanolo acidificato in ogni pozzetto e mescolare bene con una pipetta multicanale per risospendere a fondo tutti i cristalli formazano. Inizia con i pozzetti del bianco e assicurarsi di lavare le punte bene prima di procedere ad un'altra riga della piastra.
   12. Incubare la piastra a temperatura ambiente (RT) per 10 min.
   13. Utilizzando un lettore di micropiastre, determinare la densità ottica a 540 e 720 nm per garantire una misurazione accurata correggendo per lo sfondo OD. Quindi salvare i dati in un file di foglio di calcolo e analizzarlo ^4.
3. SRB test per le cellule pancreatiche Carcinoma
   1. Sciogliere SRB reagente in acido acetico 1% a una concentrazione finale di 0,4% (w / v).
   2. Sciogliere acido tricloroacetico (TCA) in acqua ultrapura a una concentrazione finale di 50% (w / v).
   3. Sciogliere Tris (idrossimetil) -aminometano in acqua ultrapura a una concentrazione finale di 10 mM.
   4. Preparare un 96 pozzetti piastra inferiore di controllo "giorno 0" piatto separato per garantire stima più accurata di inibizione della crescita: semi di 6 pozzi con le cellule che crescono in fase esponenziale a 100 di media ml a una concentrazione semina appropriato e aggiungere 100 medie ml solo per pozzi corrispondenti a spazi vuoti. Incubare per una notte a 37 ° C con 5% di CO ₂ per garantire la corretta adesione delle cellule alla piastra. Quindi aggiungere 100 microlitri di media a tutti i pozzetti e procedere ai passaggi 1.4.8 - 1.4.16 di questa sezione.
   5. Preparare un piatto sperimentale a 96 pozzetti a fondo piatto: le cellule del seme che cresce in fase esponenziale in triplice copia in 96 pozzetti piastre a fondo piatto alla densità appropriata in 100 ml di medium utilizzando una pipetta multicanale.
      NOTA: Per determinare concentrazioni ottimali di cellule di partenza, si raccomanda di valutare il profilo di crescita di ciascuna linea cellulare linea cellulare in una piastra a 96 pozzetti da semina cellule a diverse concentrazioni e misurare quotidianamente per almeno 4 giorni. Scegli una concentrazione di semina che impedisce la crescita eccessiva di cellule dopo 72 ore, in quanto questo influenzerà l'esperimento saturando i valori OD. Per le cellule Panc-1 e Panc-1R, la concentrazione ottimale di semina è di 8000 cellule / pozzetto.
   6. Aggiungere 100 microlitri medie e medio solo pozzetti e incubare una notte a 37 ° C con 5% di CO ₂ per garantire la corretta adesione delle cellule alla piastra.
   7. Preparare una serie di diluizione farmaco di gemcitabina compreso tra 1 micron e 10 nM per Panc-1 e 1 mm e 100 nM per le cellule Panc-1R. Aggiungere 100 microlitri di ogni diluizione in un pozzo appropriata della piastra a 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale. Assicurarsi di avere ogni concentrazione in triplice copia. Inoltre,aggiungere 100 ml di media ai media solo pozzi e le cellule di controllo. Incubare a 37 ° C con 5% di CO ₂ per 72 ore.
   8. Aggiungere 25 microlitri soluzione TCA freddo ai pozzetti utilizzando una pipetta multicanale e incubare le piastre per almeno 60 min a 4 ° C per precipitare e fissare le proteine ​​al fondo dei pozzetti.
   9. Svuotare la piastra rimuovendo brevemente medio e secco su un tessuto.
   10. Lavare 5 volte con l'acqua del rubinetto, quindi svuotare il piatto e lasciare asciugare a temperatura ambiente.
   11. Aggiungere 50 soluzione SRB microlitri per pozzetto utilizzando una ripetizione-pipetta e colorare per 15 min a temperatura ambiente.
   12. Svuotare la piastra rimuovendo la macchia SRB.
   13. Lavare 4 volte con acido acetico 1%, quindi svuotare la piastra e lasciare asciugare a temperatura ambiente.
   14. Aggiungere 150 microlitri soluzione Tris per pozzetto utilizzando una pipetta multicanale e miscelare per 3 minuti su una piastra-agitatore fino ad un massimo di 900 frullati / min.
   15. Leggere la densità ottica a 540 nm (o 492 nm se tegli od i valori sono troppo alti).
   16. Analizzare i dati.
4. Analisi dei dati per MTT e SRB saggi
   1. Calcolare i valori di OD di cellule a "giorno 0" con la seguente formula: OD _{Giorno 0 cellule} = _controllo OD - media _{pozzetti bianchi} OD
   2. Calcolare la percentuale di cellule sopravvissute per ogni concentrazione di farmaco secondo la seguente formula:% di cellule trattate = _{[cellule trattate} OD - media OD _{pozzetti del bianco} - OD _{Giorno 0]} Media / _{[cellule di controllo} OD - media OD _{pozzetti del bianco} - OD _Day0] * 100
   3. Tracciare la curva dose-risposta (concentrazione di farmaco vs. inibizione della crescita in%).
   4. Calcolare la concentrazione del farmaco che inibisce la crescita delle cellule del 50% (IC ₅₀₎ usando la curva dose-risposta.

2. Isolamento RNA e Biblioteca di preparazione per l'RNA-sequenziamento

1. Esempio Collessione e RNA Isolation
   1. Per le cellule CEM: raccogliere 10 ⁶ cellule direttamente dal terreno di coltura.
   2. Per Panc-1 e Panc-1R: rimuovere media, lavare le cellule due volte con PBS e staccare aggiungendo tripsina-EDTA e incubando a 37 ° C per 3 min. Aggiungere terreno di coltura e raccolto 10 ⁶ cellule.
   3. Spin down campioni a 300 xg per 3 minuti, rimuovere il surnatante ed estrarre mRNA totale utilizzando disponibili in commercio a membrana di silice colonne di rotazione, seguendo il protocollo del fornitore.
   4. Determinare la concentrazione e la purezza di RNA totale utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis.
      NOTA: RNA è considerato di elevata purezza se il rapporto di assorbanza 260 nm / 280 nm è superiore a 1,8. I campioni possono essere conservati a - 80 ° C.
   5. Valutare l'integrità RNA totale mediante elettroforesi di 200 ng di campione 1% gel colorato con bromuro di etidio.
      NOTA: Il rilevamento di due bande intatte corrispondente mammiferi 28S e 18S rRNA approssimativamente2 kb e 1 kb di dimensioni è indicativa della buona integrità RNA totale.
2. Sequencing Biblioteca Preparazione
   1. Utilizzare 2 mg di mRNA totale per ogni campione. Seguire protocollo di preparazione biblioteca mRNA secondo le istruzioni del produttore.
   2. Determinare la qualità e la concentrazione di ogni libreria usando un sistema bioanalyzer. Pool le librerie in un singolo campione fino ad una concentrazione finale di 10 nmol / L e misurare con bioanalizzatore.
   3. Usare il sistema di sequenziamento high-throughput con singola modalità di lettura di 100 bp.
      NOTA: Leggi lunghezza> 80 bp è necessaria per identificare le isoforme di trascrizione.

3. Rilevamento di splicing differenziale da Sequencing Legge

1. Allineamento della Legge di riferimento genoma e di verifica della qualità
   1. Compilare un'annotazione gene (file .gtf) dalla tabella NCBI refGene utilizzando il browser tavolo UCSC (25,963 geni).
   2. Eseguireallineamento gapped annotazione-consapevole di sequenziamento legge al genoma di riferimento (GRCh37) utilizzando STAR.
   3. Ordina e indicizzare i file di allineamento risultanti con strumenti di Picard.
   4. Eseguire il controllo della qualità post-mapping utilizzando RSeQC e samtools.
2. Differenziale splicing Detection tra gruppi campione
   1. Installare Python e le versioni corrispondenti di NumPy e SciPy. Scaricare e installare samtools. Scaricare e installare papillon e tophat,
   2. Aggiungere le directory Python, bowtie, tophat e samtools alla variabile d'ambiente PATH $. Scarica pre-costruito indici bowtie (hg19). Scarica RMATS versione 3.0.9.
      NOTA: Ulteriori dettagli su RMATS sono forniti in ¹⁹ e ^34.
   3. Rilevare eventi di splicing alternativo confrontando ciascuna linea cellulare Dex-resistente ai CEM-WT e Panc-1 a Panc-1R in MATS separata corre secondo la figura 5A.
   4. Per rilevare eventi di splicing differenziale da previoamente Il sequenziamento allineato legge (file .bam), Mats gestito utilizzando i comandi dalla figura 5B per CEM-WT vs CEM- C3, CEM-WT vs CEM-R5, CEM-WT vs CEM / R30dm e Panc1 a Panc- confronti 1R.
      NOTA: MATS creerà una cartella di output con due file txt con risultati per tipo di anomalia splicing analizzati (SE - exon skipping, A5SS - alternativa 5 'sito di splicing, A3SS - alternativa 3' sito di splicing, MEX - esoni si escludono a vicenda e RI - ritenzione introni): un file contenente i risultati in base ai conteggi di giunzione solo e un secondo file con i risultati in base ai conteggi di giunzione e legge sul bersaglio. Inoltre, un file .txt supplementare con una panoramica risultato viene generato nella stessa cartella.
   5. Per SE, A5SS, A3SS e l'importazione RI per i fogli di calcolo i file txt in base ai conteggi di giunzione e legge sul bersaglio. Per MEX importare i file .txt basati su conta solo giunzione.
      NOTA: file di output MATS è ordinato per ascendente P-valori e contiene diversi parametri: ID gene, simbolo gene, Cromosomica e la posizione filo, coordinate genomiche dei frammenti splicing alternativo, conta così come la lunghezza di inclusione e saltando forme per entrambi i campioni analizzati, la lunghezza di inclusione e forma utilizzata per la normalizzazione, p-value, false discovery rate skipping (FDR ), livello di inclusione per ciascun campione sulla base di conteggi normalizzati e il punteggio differenziale inclusione (media (IncLevel1) - media (IncLevel2)).
   6. Selezionare statisticamente significativi geni candidati con un FDR <10% per l'ulteriore validazione (ad esempio, DDX5 e PKM2).
   7. Visualizza gli eventi di splicing alternativo con Integrativa Genomica Viewer (IGV, https://www.broadinstitute.org/igv/), come riportato in Figura 5.

4. validazione dei risultati mediante RT-PCR e qRT-PCR Assays

1. disegno Primer
   NOTA: Al fine di fornire una validazione affidabile dei risultati ottenuti con il gasdotto bioinformatica, l'mRNA transcripts derivanti da eventi di splicing alternativo sono amplificati utilizzando RT-PCR e visualizzate mediante elettroforesi su gel di agarosio dei prodotti di PCR. Cyanine colorante verde come SYBR green test qRT-PCR viene utilizzato per quantificare giunzione specifiche varianti rispetto ad un gene housekeeping. Figura 7 illustra la strategia applicata per visualizzare il esone 12 skipping evento del gene DDX5 e di quantificare il escludono a vicenda esone 9 e esone 10 del gene PKM.
   1. Per il saggio RT-PCR, coppie di disegno primer ricottura per esoni costitutivi (esone 10 e esone 13) situati a monte ea valle dei siti di splicing alternativo (figura 7a).
      NOTA: La dimensione amplicone dovrebbe coprire tra 100 e 800 bp per garantire una netta separazione dei prodotti di PCR previsti su gel di agarosio. La temperatura di ricottura dei primer deve essere compresa tra 55 e 65 ° C e il contenuto GC non deve superare il 60%.
   2. Cyanine assay verde (Figura 7B). Controllare l'omologia di sequenza dei due esoni mutuamente esclusive e design due coppie di primer ciascuno dei quali specificamente e rileva esclusivamente una sola delle due varianti di splicing.
      NOTA: Per PKM, il primer inverso annealing to esone 11 comune ad entrambe le varianti, mentre i primer forward sono specifici variante e ricottura to esone 9 (PKM1) o esone 10 (PKM2).
   3. Al fine di rilevare DDX5 gene full-length, ricuocere il primer inverso all'interno del esone saltato (esone 12).
      NOTA: Per la rilevazione specifica della variante DDX5 ΔEx12, il primer inverso attraversa il confine exon11 / exon13. Utilizzare lo stesso primer forward che annealing a esone costitutiva 10 per entrambe le reazioni.
      NOTA: La dimensione amplicone deve essere compresa tra 80 e 200 bp.

I saggi di citotossicità descritti nel protocollo forniscono un metodo affidabile e robusto per valutare la resistenza delle cellule tumorali agli agenti chemioterapici in vitro. Per mezzo del saggio MTT, sensibilità alla Dex è stata determinata in quattro linee T-ALL cellulari, comprese le cellule parentali CEM-WT Dex-sensibili, e tre sublines Dex-resistenti: CEM / R30dm, CEM-R5 e CEM-C3. Due diversi intervalli di concentrazione dovevano essere utilizzati a causa della grande differenza di sensibilità tra CEM-WT (2 mM - 0,97 nM) e le linee cellulari resistenti Dex (640 pM - 0,33 nM). Il saggio MTT mostrava chiaramente una resistenza Dex in CEM / R30dm (IC 50 = 456 ± 49 pM), CEM-R5 (IC 50> 640 pM) e CEM-C3 (IC 50 = 386 ± 98 pM) rispetto al CEM- cellule WT (IC 50 = 0,028 ± 0,003 micron). Allo stesso modo il saggio SRB ha dimostrato un'elevata resistenza gemcitabina nella linea cellulare Panc-1R (IC50 = 3.16 ± 0.01 mM) rispetto ai parentali Panc-1 le cellule (IC 50 = 0,077 ± 0,03 mM) come mostrato in Figura 2.

A seguito della conferma di resistenza ai farmaci in tutte le linee cellulari considerate, abbiamo accanto è proceduto all'isolamento mRNA, la preparazione biblioteca e RNA-sequenziamento. Estrazione di mRNA totale utilizzando membrane di silice colonne di rotazione è la scelta preferita rispetto ad altri metodi in quanto evita fenolo e proteine ​​contaminazione e fornisce elevata purezza del campione con 260 nm / 280 nm rapporto di assorbanza nettamente superiore 1.8. Questo è un requisito fondamentale per applicazioni a valle complesse come sequenziamento. Il metodo utilizzato per verificare l'integrità dei campioni di RNA da agarosio 1% è particolarmente adatto per le cellule appena isolate (Figura 3). Poiché lo scopo di questo protocollo è quello di individuare varianti di splicing alternativi aberrante espressi in linee cellulari resistenti ai farmaci, abbiamo scelto selectio positivon di mRNA poliadenilato per la preparazione biblioteca di sequenza, utilizzando kit di mRNA non recuperabili. Elettroferogrammi di biblioteche e singoli pool sono rappresentati in figura 4, che mostra una dimensione del frammento media di circa 300 bp, coerentemente ai requisiti del sistema di sequenziamento. Le librerie preparate sono poi stati sequenziati usando un chip con singolo Leggi la modalità 100 bp. La scelta di sequenziamento legge di 100 bp è necessario rilevare splicing alternativo attraverso condutture bioinformatici a valle.

Dopo fasi di lavorazione iniziali e di controllo della qualità, la pulizia si legge allineato al genoma umano (hg19) sono stati sottoposti ad analisi differenziale splicing utilizzando stuoie. In questa analisi abbiamo fatto confronti tra il sensibile linea cellulare parentale droga e ciascuno del proprio farmaco sublines resistenti separatamente (cioè, CEM WT vs CEM / R30dm, CEM WT vs CEM-C3, ecc). MATS si basa su un modello statistico flessibile e precisoutilizzato per rilevare splicing differenziale tra i campioni. Utilizzando le opzioni di analisi predefinite e un valore FDR <10% come un cut-off (rappresentato nella figura 5B), siamo stati in grado di identificare 38 ± 12 importanti geni candidati differenzialmente splicing per confronto ordinato per tipo di evento splicing alternativo, con la maggior parte dei colpi classificato come exon skipping. La figura 6 illustra una uscita tipica analisi per il confronto Panc-1 vs. Panc-1R.

Ci siamo concentrati ulteriormente il nostro studio su due tipi più comuni di eventi di splicing alternativo: exon skipping ed eventi esone mutuamente esclusive con un candidato rappresentante per categoria descritto di seguito. DDX5 (DEAD-box elicasi 5) è stato rilevato da analisi MATS come statisticamente significativa nel confronto CEM-WT vs CEM-C3 e CEM-R5, ma non significativo nel confronto CEM-WT vs CEM / R30dm. Dato il suo ruolo putativo nella leucemia 25,26, abbiamoscegliere questo candidato per un ulteriore convalida. Si consiglia vivamente di visualizzare i dati di RNA-Seq in uno strumento di browser come genoma. IGV fornisce un'interfaccia versatile e di facile utilizzo per questo scopo, come mostrato in figura 7 per la DDX5 gene candidato. PKM (piruvato chinasi muscolare isoenzima) è un evento statisticamente significativo esone escludono a vicenda nel confronto CEM-WT vs tutti sottolinee Dex resistenti, ma non nel confronto Panc-1 vs Panc-1R. Data la rilevanza di questo enzima nel metabolismo tumore solido 27,28 e il ruolo emergente del metabolismo cellulare nella resistenza glucocorticoidi in T-ALL 29, abbiamo scelto questo candidato per l'ulteriore validazione usando RT-PCR.

progettazione Primer deve essere condotta con estrema cura, al fine di amplificare l'amplicone corretto, soprattutto quando primer ricottura to esone-esone confini (in caso di primer inverso rilevare DDX5 ΔEx12 variante) o quando they ricottura a reciprocamente esoni esclusive con alta omologia di sequenza (esone 9 e esone 10 della PKM). Figura 8 mostra la strategia di progettazione di primer, mentre la Figura 9 mostra i risultati di una RT-PCR per gene DDX5 candidato. DDX5 ΔEx12 viene rilevato nel campione CEM-WT e CEM / R30dm ma non in CEM-C3 e CEM-R5, confermando così i dati MATS in maniera qualitativa. Cyanine verde assay qRT-PCR quantifica accuratamente i livelli di espressione di mRNA delle varianti DDX5 e PKM giunzione, come mostrato in Figura 10 e Figura 11, rispettivamente.

Figura 1: Rappresentazione schematica di splicing alternativo eventi. Rappresentazione schematica dei possibili modelli di splicing alternativo di un gene. Le scatole sono esoni discreti che possono essere inclusi o esclusi dal mR indipendenteNA trascrizione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2: I risultati di citotossicità saggi. (A) saggio MTT per linee di cellule leucemiche mostra alti livelli di resistenza desametasone in CEM-C3 (IC50 = 386 ± 98), CEM-R5 (IC 50> 640 micron) e CEM / R30dm (IC50 = 456 ± 49 mM ) rispetto al parentale CEM-WT (IC 50 = 0,028 ± 0,003 mM). Saggi (B) SRB per linee cellulari di carcinoma pancreatico rivelano alti livelli di resistenza gemcitabina in Panc-1R (IC 50 = 3.16 ± 0.01 mM) rispetto al parentale Panc-1 (IC 50 = 77.22 ± 2.76 nM). I grafici riportano media la crescita delle cellule% ± SEM di tre Indipesperimenti Endentski. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3: La valutazione della qualità RNA utilizzando un gel. Duecento ng di mRNA totale sono stati eseguiti su 1% gel colorato con bromuro di etidio. La presenza di bande intatti corrispondenti a RNA ribosomiale (rRNA) specie 18S e 28S e l'assenza di strisci a pesi molecolari bassi sono indicativi di buona qualità dell'RNA. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4: <strong> Tracce Bioanalyzer di sequenziamento librerie. (A) elettroferogrammi di sequenziamento librerie mostrano picchi di circa 300 bp, che è indicativo di buona qualità. Esempio 1 a 6 = CEM-WT, CEM-C3, CEM-R5, CEM / R30dm, Panc-1 e Panc-1R. (B) elettroferogramma dei campioni aggregati (FU, Fluorescenza unità).

Figura 5: Rilevazione dello splicing differenziale con stuoie. (A) il confronto di gruppo e gli script (B) utilizzati per eseguire stuoie. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6: <em> MATS Stampa elenco. La figura mostra una tipica uscita di analisi MATS in un software con i fogli di calcolo: qui sono riportati i candidati differenziale giuntati nel confronto Panc-1 vs Panc-1R per gli eventi exon skipping (FDR <10%). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Visualizzazione dello splicing differenziale di DDX5 Candidato Gene attraverso IGV Genome Browser. I file con allineato legge (.bam) corrispondente a cellule leucemiche sono stati caricati sul navigatore IGV genoma e visualizzati utilizzando trame Sashimi (conta di giunzione valore minimo = 10 di visualizzare significativi eventi di splicing). conta di giunzione Splice sono rappresentate da linee di collegamento eun numero corrispondente al RNA-Seq si legge che attraversa i esoni. CEM-WT e CEM / R30dm mostrano conteggi saltare abbracciano dell'esone 11 to esone 13 rispetto ai CEM-C3 e CEM-R5, che non mostra alcun esone 12 skipping. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Disegno Primer per RT-PCR e Cyanine verde qRT-PCR. (A) RT-PCR: coppie di primer rilevamento differenziale splicing di DDX5 ricottura per esoni costitutivi (esone 10 e esone 13) situati a monte ea valle delle esoni splicing alternativo. (B) test di qRT-PCR: per la relativa quantificazione dei trascritti derivanti da eventi exon skipping rispetto alle trascrizioni canoniche, il primer inverso annealing sia all'interno saltato esone (variante alternativa) oal confine exon11 / exon13 (variante canonica) del gene DDX5. Per la quantificazione degli esoni si escludono a vicenda, il primer inverso annealing to esone 11 comune ad entrambe le isoforme, mentre il primer ricottura in avanti sia per nell'esone 9 (PKM1) o esone 10 (PKM2). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 9: RT-PCR convalida di DDX5 splicing differenziale. Il gel di agarosio 1% mostra splicing differenziale del gene DDX5 in cellule leucemiche. Il frammento corrispondente alla DDX5 intera lunghezza dell'amplicone (650 bp) è amplificato in tutti i campioni, mentre DDX5 ΔEx12 (430 bp) variante è amplificato in CEM-WT e CEM / R30dm campioni e la dimensione corrisponde a Exon skipping 12. Questo non viene rilevata nelle cellule CEM-C3 e CEM-R5, come deterrenteminato dall'analisi stuoie. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 10: i livelli di espressione di mRNA di DDX5 Splice varianti in cellule CEM. Saggio (A) qRT-PCR. I livelli medi di espressione relativi e l'errore standard della media (REL ± SEM) di due esperimenti indipendenti. (B) Rapporto di REL (± SEM) delle varianti di splicing. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 11: mRNA espressione Livellos di PKM Splice varianti in CEM e Panc-1 le cellule. Saggio (A) qRT-PCR. I livelli medi di espressione relativi e l'errore standard della media (REL ± SEM) di due esperimenti indipendenti e il rapporto di REL delle varianti di splicing per le cellule CEM. Saggio (B) qRT-PCR. Media REL ± SEM di due esperimenti indipendenti e il rapporto di REL (± SEM) delle varianti di splicing per Panc-1 le cellule. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.