Utilizzando RNA-sequenziamento per rilevare Novel Splice varianti correlati alla resistenza ai farmaci in<em&gt; In Vitro</em&gt; modelli di cancro

Sommario

Qui si descrive un protocollo volto ad indagare l'impatto di aberrant splicing sulla resistenza ai farmaci nei tumori solidi e le neoplasie ematologiche. A questo scopo, abbiamo analizzato i profili trascrittomica dei modelli genitoriali e resistenti in vitro attraverso RNA-Seq e stabilito un metodo basato qRT-PCR per convalidare geni candidati.

Abstract

La resistenza ai farmaci rimane un problema importante nel trattamento del cancro sia per neoplasie ematologiche e tumori solidi. resistenza intrinseca o acquisita può essere causato da una serie di meccanismi, tra cui una maggiore eliminazione del farmaco, diminuito assorbimento di droga, l'inattivazione di droga e alterazioni dei bersagli farmacologici. Dati recenti hanno mostrato che oltre dal noto genetica (mutazione, amplificazione) ed epigenetici (metilazione del DNA, istoni modificazioni post-traduzionali) modifiche, i meccanismi di resistenza ai farmaci potrebbe anche essere regolata da aberrazioni splicing. Si tratta di un settore in rapida crescita di indagine che richiede un'ulteriore riflessione al fine di pianificare approcci terapeutici più efficaci. Il protocollo descritto in questo documento ha lo scopo di investigare l'impatto di aberrant splicing sulla resistenza ai farmaci nei tumori solidi e le neoplasie ematologiche. A questo scopo, abbiamo analizzato i profili trascrittomica di diversi modelli in vitro attraverso RNA-Seq e stabilireEd un qRT-PCR metodo basato per convalidare geni candidati. In particolare, abbiamo valutato la splicing differenziale di DDX5 e PKM trascrizioni. Il aberrant splicing rilevato dallo strumento computazionale MATS stato convalidato in cellule leucemiche, mostrando che le diverse varianti di splicing DDX5 sono espresse nelle cellule resistenti vs parentale. In queste cellule, abbiamo anche osservato un rapporto più elevato PKM2 / PKM1, che non è stato rilevato nel Panc-1 controparte gemcitabina-resistenti rispetto ai genitori Panc-1 le cellule, suggerendo un diverso meccanismo di farmaco-resistenza indotta dall'esposizione gemcitabina.

Introduzione

Nonostante i notevoli progressi nel trattamento del cancro, la resistenza delle cellule maligne alla chemioterapia, sia intrinseco o acquisito in seguito ad esposizione al farmaco prolungata, è il motivo principale per il fallimento del trattamento in una vasta gamma di leucemie e tumori solidi ^1.

Al fine di delineare i meccanismi alla base della resistenza ai farmaci, in modelli in vitro di linee cellulari sono stati sviluppati da selezione graduale di cellule tumorali resistenti agli agenti chemioterapici. Questa procedura imita i regimi utilizzati nelle impostazioni cliniche e permette quindi a un'indag....

Protocollo

1. Caratterizzazione di Profili di droga resistenza attraverso citotossicità Assays

1. Leucemico Cell Culture Linea
   1. Mantenere il T-cellule parentali ALL linea cellulare CCRF-CEM (CEM-WT) così come i suoi sublines resistenti ai farmaci, tra CEM / R30dm, CEM-R5 e CEM-C3, nel 25 cm ² in media 10 ml RPMI-1640 contenente 2.3 mM di acido folico supplementato con 10% siero fetale di vitello e di 100 unità / ml di penicillina G e 100 ug / ml di streptomicina.
   2. Cultura le cellule in atmosfera umidificata a 37 ° C in un incubatore CO ₂ 5%.
   3. Lasciare crescita cellulare a concentrazioni tra 2 - 3 x 10

Risultati

I saggi di citotossicità descritti nel protocollo forniscono un metodo affidabile e robusto per valutare la resistenza delle cellule tumorali agli agenti chemioterapici in vitro. Per mezzo del saggio MTT, sensibilità alla Dex è stata determinata in quattro linee T-ALL cellulari, comprese le cellule parentali CEM-WT Dex-sensibili, e tre sublines Dex-resistenti: CEM / R30dm, CEM-R5 e CEM-C3. Due diversi intervalli di concentrazione dovevano essere utilizzati a causa della grande d.......

Discussione

Qui si descrive un nuovo approccio che combina tecniche di screening di citotossicità consolidate e potente trascrittomica NGS a base di analisi per identificare eventi di splicing differenziali in relazione alla resistenza ai farmaci. Analisi spettrofotometriche sono metodi high-throughput convenienti e affidabili per valutare la sensibilità ai farmaci in modelli tumorali in vitro e rappresentano la prima scelta per molti laboratori che effettuano proiezioni di citotossicità. Risoluzione dei problemi così come.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Sulforhodamine B	Sigma-Aldrich	230162
Acido tricloroacetico	Sigma-Aldrich	251399
CCRF-CEM	ATCC, Manassas, VA, USA	ATCC CCL-119
Panc-1	ATCC, Manassas, VA, USA	ATCC CRL-1469
DMEM ad alto glucosio	Lonza, Basilea, Svizzera	12-604F
RPMI-1640	Gibco, Carlsbad, CA, USA	11875093
Siero fetale bovino e vitello	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germania	758093
penicillina G streptomicina solfato	Gibco, Carlsbad, CA, USA	15140122
Tris(idrossimetil)-aminometano	Sigma Aldrich	252859
MTT formazan	Sigma Aldrich	M2003
Anthos-Elisa-reader 2001	Labtec, Heerhugowaard, Paesi Bassi		Spettrofotometro UV-Vis a 96 pozzetti
Greiner CELLSTAR Piastre a 96 pozzetti	Greiner/Sigma	M0812-100EA
Soluzione di tripsina/EDTA 100 ml	Lonza, Basilea, Svizzera	CC-5012
CELLSTAR Fiasche per colture cellulari 25 cm2	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germania	82051-074
Fiasche per colture cellulari CELLSTAR 75 cm3	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germania	82050-856
Soluzione salina tamponata con fosfato (NaCl 0,9%)	B.Braun Melsungen AG, Germania	362 3140