Analisi spazio-temporale di Cytokinetic Eventi in lievito di fissione

Citocinesi, la fase finale di divisione cellulare, è un processo complesso indispensabile per il corretto differenziazione, lo sviluppo e la sopravvivenza di un organismo. Citochinesi coinvolge molteplici eventi che vengono organizzati per garantire il successo di separazione cellulare pur mantenendo l'integrità genomica ^1. Citochinesi comporta eventi in cui un anello actomiosina volta assemblato subisce costrizione, che è concomitante con l'espansione della membrana e Assolcatore e rimodellamento della matrice extracellulare cellulare, infine seguita da abscission cella ^{1, 2, 3.} Organizzazione improprio di eventi cytokinetic può portare a difetti di separazione cellulare e ploidia, e può causare malattie come il cancro ^{4, 5, 6, 7, 8.} I principi fondamentali che consentono organizzazione di eventi cytokinetic non sono ben compresi, determinando in tal modo posti di blocco nella nostra comprensione della eziologia di queste malattie.

Il pombe Schizosaccharomyces fissione lievito (S. pombe) è un sistema modello eccellente per studiare cytokinesis a causa della natura conservata delle proteine coinvolte ^1. Nel lievito di fissione, dopo actomyosin gruppo ad anello, l'anello entra in una fase di maturazione / di sosta dove non costrizione ^9. Maturazione termina con l'inizio di costrizione anello actomiosina, in concomitanza con Assolcatore membrana e setto ingression. Lavoro seminale nel corso degli anni ci hanno dato una discreta comprensione di assemblaggio dell'anello actomiosina nel lievito di fissione ^{1, 9, 10.} In alcuni eucarioti, compreso lievito di fissione, di successo assemblaggio dell'anello actomiosina non è sufficiente per Assolcatore membrana. in fissione lievito, anello di costrizione da solo non fornisce una forza sufficiente a superare la pressione di turgore interna per la formazione solco ^11. Un modello recente indica che questa forza è invece fornita da setto ingression ^11. In un altro modello, il ruolo di estensione membrana plasmatica è stato suggerito di contribuire alla formazione solco ^{12, 13.} Anello costrizione e Assolcatore membrana non si verificano in temperatura Bgs1 / CPS1 sensibile cps1-191 mutante, il principale enzima per la formazione del setto primaria ^{14, 15.} Le cellule prive Bgs1 mostrano setto primaria difettosa e prolungata costrizione anello ^{15, 16.} Bgs1 viene reclutato per il sito di divisione cellulare per setto ingressione durante la maturazione dopo actomiosina gruppo dell'anello di ^{17, 18.} Similarly, durante cellularization in embrioni di Drosophila, anello di costrizione è bifasica con un tasso di costrizione iniziale di rallentare significativamente ^19, che assomiglia alla fase di maturazione osservato nel lievito di fissione. Bifasica costrizione anello potrebbe rallentare Assolcatore membrana per consentire l'espansione della membrana sufficienti ²⁰ e la modifica di matrice extracellulare. Ciò suggerisce che, dopo il montaggio actomyosin anello, anello di costrizione si verifica in modo efficiente solo quando la cellula ha soddisfatto i requisiti per la formazione del solco. Non è ben chiaro quali condizioni sono necessarie per costrizione anello actomiosina dopo l'assemblaggio anello, né gli eventi molecolari che regolano questo processo. Abbiamo recentemente dimostrato che in seguito anello actomiosina assemblaggio piccola GTPasi Cdc42 subisce un pattern di attivazione spazio-temporale unico ^21. Questo modello è stabilito dal pattern di localizzazione unica dei fattori di scambio guanidina nucleotide Cdc42 (GEFs) che attivano Cdc42. Il GEF GEF1 localizza all'anello actomiosina assemblato e favorisce l'insorgenza di costrizione ring e setto ingressione, mentre scd1 localizza alla membrana che solca e promuove la normale formazione del setto. Troviamo che il pattern di attivazione Cdc42 istituito dalle sue GEFs portano alla regolazione degli eventi cytokinetic distinti.

Per comprendere il meccanismo molecolare di eventi che alla fine portano alla separazione delle cellule dopo il montaggio anello actomiosina, si ha la necessità di seguire gli eventi cytokinetic distinti nel tempo e nello spazio. Nel lievito di fissione, cytokinesis prima prevede l'assemblaggio dei nodi precursori attorno al nucleo, che alla fine reclutano la miosina di tipo II, la Formin Cdc12, e altre proteine ​​necessarie per il montaggio dell'anello actomiosina. Per ora gli eventi cytokinetic distinti e fornire un quadro di riferimento, la separazione dei marcatori del corpo poli del fuso (formazione del fuso) è considerato come tempo 0 ^22. L'assemblaggio di thanello actomiosina e può essere seguito da monitorare nel tempo l'intensità di una proteina anello actomiosina fluorescently etichettato come il tipo II miosina catena leggera normativo Rlc1. Qui si descrive un approccio microscopico per analizzare diverse fasi di cytokinesis nel corso del tempo.

1. Preparazione del campione

1. Crescere cellule di lievito di fissione che esprimono il marcatore palo fuso corpo sad1-mCherry ²³ e di tipo II miosina catena leggera normativo Rlc1-pomodoro ²⁴ in YE mezzi liquidi a 32 ° C per 8 generazioni.
   NOTA: per i mutanti sensibili alla temperatura, crescere le cellule a 25 ° C. Crescere le cellule a fase di mid-log a un OD ₆₀₀ di 0,5 YE. Per maggiori informazioni sulla fissione condizioni di crescita del lievito si riferiscono al lievito di fissione manuale di laboratorio ^25.
2. Preparate (o minimi) media con 0.6% agarosio (supporti basati agarosio mostrano sfondo meno fluorescenti rispetto alle agar). Per il supporto fuso aggiungere 1 mM di acido ascorbico (vitamina C). La vitamina C placa i radicali liberi che vengono rilasciati a causa di foto-sbiancamento, minimizzando così foto-tossicità.
3. Versare 3 - 4 ml di vitamina C cucita fuso media su di un piatto di cultura fondo di vetro. Lasciare raffreddare e solidificare i media.
   Notare laspessore del vetro nel piatto cultura dipende dallo spessore vetrino adatti per il microscopio. Qui, l'uso vetrino No. 1.5.
4. alzare delicatamente il supporto solidificato dal piatto cultura con l'aiuto di un bisturi affilato. Inserire un puntale tra la soletta media e piatto cultura per impedire la lastra di ricadere nel piatto (Figura 1).
5. Prendere 1 ml di cellule fresche che crescono come descritto al punto 1.1. Spin le cellule delicatamente a 300 xg per 30 s. Eliminare il surnatante. Risospendere le cellule in piccola quantità di materiale residuo che rimane nel tubo dopo aver scartato il surnatante.
6. Carico 2 - 5 ml di coltura cellulare risospeso tra la soletta media e il fondo di vetro del piatto cultura. Le cellule devono essere sul vetro. La punta della pipetta posto tra i media e il piatto permette un facile caricamento della coltura cellulare.
7. Molto rimuovere delicatamente la punta della pipetta e posizionare la lastra dei media nella sua posizione originale sul cupiatto lture. Assicurati di evitare eventuali bolle d'aria. Se necessario premere delicatamente le bolle d'aria facendo scorrere la parte posteriore di un puntale sulla parte superiore della lastra media.
8. Lasciare le cellule siedono nel piatto di coltura per 30 minuti a un'ora al buio a temperatura alla quale verrà eseguita microscopia. Questo è importante per evitare urti dovuti al cambiamento delle condizioni di crescita per le cellule.

2. Acquisizione di immagini

1. Mettere una goccia di olio sul lato esterno del vetro sul piatto di coltura. Posizionare il piatto di coltura su un microscopio invertito.
2. Per ridurre al minimo automatica di fluorescenza di YE mezzi utilizzare un filtro GFP con una lunghezza d'onda ristretta (520-535 nm).
3. Focus sul piano mediale delle cellule e garantire che essi sono ben distanziati e non troppo affollata. Assicurarsi di iniziare l'acquisizione di immagini delle cellule nella fase adeguata del ciclo cellulare. Per questo esperimento, seguire le cellule da fine G2.
4. Programmare il software di acquisizione delle immagini to prendere GFP, RFP e le immagini DIC delle cellule.
   1. Per questo esperimento utilizzare il 100 ms tempo di esposizione per DIC e 75 ms tempo di esposizione per i filtri GFP e RFP. Il tempo di esposizione dipende dalle impostazioni del microscopio, la proteina in esame e la durata dell'esperimento. Per le date impostazioni microscopio, utilizzare il 50% della potenza del laser.
   2. Per catturare le immagini in 3 dimensioni, programmare il software di acquisizione di immagini per l'imaging Z-scala. Utilizzare un passo di 0,4 micron e una distanza di 3,0 micron (metà del totale z) attorno al punto focale centrale delle cellule. Questo porta alla cattura di 16 Z fotogrammi al punto temporale con una distanza totale Z di 6 micron.
      NOTA: acquisizione delle immagini Z-series consente la cattura dei corpi polari mandrino.
5. Prendere immagini ogni 2 min. Modificare il tempo di esposizione in base alle esigenze dell'esperimento. Il tempo di esposizione può anche essere modificata in base alla proteina di interesse e la potenza del segnale. Si noti tuttavia che a breveer intervalli o tempo di esposizione incremento foto-tossicità dovuta allo sbiancamento e quindi cellule possono essere seguite solo per un breve periodo.
6. Acquisire le immagini fino a quando le cellule fisicamente separati come osservato dalle immagini DIC, o programmare il software per fermare l'acquisizione dopo 90 min.

Analisi 3. Immagine

1. Analisi temporale degli eventi cytokinetic
   1. Utilizzando il software di acquisizione immagini fare proiezioni di Z-frame per ogni time-point. Rendere i file diversi per ogni lunghezza d'onda di immagine acquisita.
   2. Esportare questa serie di time-punto di proiezione in formato .tiff.
   3. Analizzare le immagini utilizzando il software ImageJ. Aprire la serie di immagini per una qualsiasi delle lunghezze d'onda.
   4. Selezionare una cella da studiare. Fare doppio clic sull'opzione linea di barra degli strumenti. Si aprirà una nuova finestra per regolare la larghezza della linea. Regolare la larghezza della linea per corrispondere alla larghezza della cella. Per una cella WT questo è di circa 40 - 50 pixel. Tracciare una linea lungo laasse lungo della cella di interesse.
   5. Clicca su Analizza> Strumenti> Gestione ROI e fare clic su Aggiungi. Questo aggiungerà la linea selezionata nella finestra di ROI per un uso successivo. Non chiudere questa finestra.
   6. Clicca sull'immagine di interesse e selezionare Modifica> Selezione> Raddrizza. Si aprirà un'altra finestra. Controllare "Processo intero stack". Ciò raddrizzare il cellulare in orizzontale.
   7. Clicca su Immagine> Trasforma> Ruota di 90 gradi a destra. Questa immagine viene ora raddrizzata verticalmente.
   8. Clicca su Immagine> Stack> Crea Montaggio. Si aprirà una finestra per assegnare il numero di righe e colonne per la pila, il fattore di scala per la dimensione dell'immagine, la prima e l'ultima fetta (frame) per il montaggio e l'incremento cornice per il montaggio. Controllare fette di etichette e premi invio.
   9. Come viene mostrato una finestra con un montaggio della cella di interesse, aprire la serie di immagini per l'altra lunghezza d'onda.
   10. Clicca sul identificatore line sul ROI manager. Questo selezioneràstessa cella sul secondo file di immagine. Ripetere i punti 3.1.6 - 3.1.8. Questo aprirà un montaggio della seconda immagine.
   11. Sull'immagine con il marcatore palo corpo mandrino sad1-mCherry, cercare insorgenza di separazione del marcatore pole corpo del mandrino e segnare quel punto di tempo come tempo 0.
   12. Seguire il segnale Rlc1-pomodoro sull'immagine nel tempo e cercare il segnale che appare come una linea distinta rispetto a macchie di Rlc1-pomodoro. Questa volta-punto segna il completamento del montaggio dell'anello actomiosina / inizio della fase di maturazione.
   13. Avanti scorrere il filmato nel corso del tempo per determinare quando l'anello Rlc1-pomodoro inizia a diminuire in termini di dimensioni. Questo è contrassegnato come la fine della maturazione di fase / insorgenza di anello di costrizione.
   14. Seguire il segnale Rlc1-pomodoro nel tempo durante costrizione finché non appare come un punto nel centro dell'asse cella. Questo è contrassegnato come la fine di anello di costrizione / fine del setto ingression.
   15. A seguito del montaggio di immagini DIC, determinare la cellula finaleseparazione. Registrare il punto di tempo in cui la cella separa fisicamente.
   16. Per mandrino separazione polo corpo misurare la distanza tra i due corpi polari del fuso nel tempo utilizzando lo strumento della riga di ImageJ. Tracciare la distanza in corpo poli mandrino nel tempo.
   17. Registrare i diversi punti temporali per i diversi eventi cytokinetic per calcolare la durata di ogni fase cytokinetic e confrontare con mandrino separazione corpo palo nel corso del tempo.
2. Analisi spaziale di eventi cytokinetic
   1. Selezionare una cella con un anello actomiosina visibile. Fare doppio clic sull'opzione linea di barra degli strumenti ImageJ. Si aprirà una nuova finestra per regolare la larghezza della linea. Regolare la larghezza della linea per corrispondere allo spessore dell'anello (15 - 20 pixel). Tracciare una linea lungo l'anello avendo cura di assicurare l'intero spessore dell'anello è incluso.
   2. Clicca su Analizza> Strumenti> Gestione ROI e fare clic su Aggiungi. Questo aggiungerà la linea selezionata nella finestra di ROI per un uso successivo.Non chiudere questa finestra.
   3. Clicca sull'immagine di interesse e selezionare Modifica> Selezione> Raddrizza. Si aprirà un'altra finestra. Controllare "Processo intero stack". Questo raddrizzare l'anello in senso orizzontale.
   4. Ripristinare l'intensità del piano luminoso nel z-stack raddrizzata (da 3.1.6) utilizzando Immagine> Regola> Luminosità / Contrasto> Ripristina.
   5. Fare clic sulla scheda Stk> Progetto 3D. Si aprirà una finestra di dialogo. Cambiare il metodo di proiezione di Brightest Point e la spaziatura fetta di 2 o 3 pixel. Infine, l'asse di rotazione del cambiamento a X o Y (questo cambierà a seconda dell'angolo di visuale desiderata), fare clic su interpolare e fare clic su OK per generare una proiezione in 3D delle immagini. Utilizzare la barra di scorrimento sotto l'immagine per ruotare l'immagine.
   6. Aprire la serie di immagini per l'altra banda di frequenza con ImageJ.
   7. Clicca sul identificatore line sul ROI manager. Questo selezionerà lo stesso anello sul secondo file di immagine. Ripetere i punti 4.2.4 e 4.2.5.Si aprirà un anello dimensionale 3 nell'immagine con l'altra lunghezza d'onda.
   8. Con i due anelli di immagini 3D aperte, cliccare su Immagine> Colore> Unisci canali. Si aprirà una scatola. Selezionare ogni immagine dal menu a discesa per il colore corrispondente desiderato verso il basso e fare clic su OK. Questo aprirà un composito di entrambe le immagini a diverse lunghezze d'onda.
   9. Confrontare la localizzazione di diversi marcatori per quanto riguarda la localizzazione presso l'anello cytokinetic o membrana ingressing. Rlc1-GFP è un marker per l'anello cytokinetic. Le proteine ​​co-localizzazione con Rlc1-GFP localizzano sul ring mentre le proteine ​​localizzazione dietro segnale Rlc1-GFP localizzare alla membrana ingressing.
      NOTA: La proteina di interesse deve essere di un fluoroforo diversa da quella del marcatore anello.
   10. Generare 3 anelli tridimensionali durante le diverse fasi di cytokinesis per confrontare la localizzazione spaziale delle proteine ​​per tutto cytokinesis.
3. Analisi di distri proteinebuzione in corrispondenza della tangenziale cytokinetic
   1. Per confrontare e analizzare la distribuzione delle proteine ​​lungo l'anello misurare il coefficiente di variazione della distribuzione delle proteine. Un alto coefficiente di varianza indica distribuzione non uniforme delle proteine ​​lungo il sito divisione e suggerisce di montaggio anello improprio, la maturazione o la formazione del setto, a seconda di quale fase è ripreso e analizzato.
   2. Utilizzando 3 dimensionale anello cytokinetic ricostruito (da 3.2.2), dividere l'immagine in almeno 4 quadranti in modo tale che un quarto del ring appare in ogni quadrante. Per questo utilizzare lo strumento linea per disegnare linee perpendicolari sull'immagine. Dopo ogni linea Clicca sull'immagine> Sovrapposizione> Aggiungi selezione o utilizzare scorciatoia Ctrl + B.
   3. Vai a Analizza> set di misura. Selezionare valore di grigio medio nel dialogo che si apre. Fare clic su OK.
   4. Utilizzando le linee tracciate sopra come guide disegnare un rettangolo per definire ogni quadrante con lo strumento rettangolo.
   5. Per misurare l'intensità media di ciascun quadrante, clicksu Analizza> Misurare o utilizzare la scorciatoia Ctrl + M.
   6. Registrare il valore di grigio medio per tutti i quattro quadranti (MG ₁ -MG _4).
   7. Seleziona una piccola area in ogni quadrante fuori dal ring come selezione sfondo.
   8. Misurare valore di grigio medio per la selezione di sfondo per tutti i quattro quadranti (BG ₁ -BG _4).
   9. li> Per sottrazione dello sfondo per ogni uso quadrante la seguente formulazione MG ₁ -Average (BG _1: BG ₄₎ = Intensità di anello in ogni quadrante (IRQ). In questa fase non sono 4 valori IRQ, uno per ogni quadrante.
   10. Successivo calcolare il coefficiente di variazione per ogni anello utilizzando la seguente formulazione Deviazione standard (IRQ _1: IRQ ₄₎ / medio (IRQ _1: IRQ _4). Calcolare medio coefficiente di varianza per ogni ceppo e confrontare agli altri ceppi.
       NOTA: un aumento statisticamente significativo coefficiente della varianza in un ceppo rispetto ai controlli Indicates irregolare proteina distribuzione / erogazione lungo il sito divisione in quella fase della citocinesi.

Cellule di lievito di fissione che esprimono il marcatore anello, Rlc1-GFP (green, Figura 2) e il mandrino marcatore palo corpo sad1-mCherry (rosso, figura 2) sono stati ripresi durante cytokinesis. L'insorgenza di marcatore palo corpo mandrino (freccia bianca, figure 2A, B) è considerato come tempo 0. segnale Rlc1-GFP appare al momento -4 min con riferimento al mandrino separazione corpo palo (freccia rossa, figure 2A, 2B). Segnale Rlc1-GFP forma un continuo anello 10 minuti dopo la separazione del mandrino corpo palo (freccia aperta, figure 2A, B) che segna la fine del montaggio dell'anello actomiosina. L'anello actomiosina (Rlc1-GFP) inizia a diminuire in larghezza 22 minuti dal completamento del montaggio dell'anello e 32 min dopo mandrino pole separazione corpo (freccia chiusa, figure 2A, B). Anello costrizione si conclude 20 minuti dopo l'inizio della costrizione, 42 min da insorgenza di assemblaggio dell'anello e 52 min da separazione polo mandrino corpo (Asteris bianchik, figure 2A, B). Infine, abscission cellule avviene 72 minuti dopo la separazione del mandrino corpo palo (punta di freccia rossa, figure 2A, B).

La localizzazione del marcatore anello Rlc1-pomodoro e marcatore di membrana setto Bgs1-GFP sono stati analizzati presso il sito divisione tutta cytokinesis. Ricostruzione 3D del ring ha rivelato che l'anello actomiosina contrassegnati con Rlc1-pomodoro assemblato prima di reclutamento Bgs1-GFP (Figura 3, 10 min). Durante la fase di maturazione anello Bgs1-GFP è stato reclutato per il sito di divisione e si sovrappone con l'anello actomiosina come mostrato da Rlc1-pomodoro (Figura 3, 30 min). Ciò indica che Bgs1 localizza all'anello di assunzione. Come l'anello restringe, Bgs1-GFP localizza anche alla membrana ingressing adiacente al anello costrittivo (Figura 3, 40 min). Alla fine della costrizione, il segnale Bgs1-GFP è visibile nella parte barri membrana ingresseder (Figura 3, 50 min). Infine, dopo il segnale di costrizione Rlc1-pomodoro è assente, mentre Bgs1-GFP sembra localizzare tutta barriera a membrana con un disco aspetto simile (figura 3, 60 min). Così queste osservazioni indicano che il setto sintesi dell'enzima Bgs1 localizza sul ring dopo il montaggio e persiste dopo la costrizione anello alla barriera di membrana come è stato riportato prima del 17.

La distribuzione delle proteine lungo l'anello actomiosina stata analizzata per determinare l'efficienza di eventi cytokinetic (Figura 4). La distribuzione non uniforme o nonhomogenous delle proteine lungo l'anello actomiosina è stata associata con segnalazione alterata e montaggio anello inefficiente cytokinetic 26. Qui vi mostriamo due anelli 3D ricostruito durante la fase di maturazione, che esprimono la proteina F-Bar Cdc15-GFP (Figura 4). L'immaginea sinistra mostra una distribuzione di Cdc15-GFP lungo l'anello con un basso coefficiente di variazione (0,098), mentre l'immagine in destra mostra distribuzione irregolare con un alto coefficiente di variazione (0.226, Figura 4).

Figura 1: Preparazione di cultura piatto per l'imaging. Schema inoculazione descrivendo delle cellule in un piatto di cultura fondo di vetro sovrapposte con il rilievo di media. Vedere protocollo per i dettagli (sezione 1). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2 Tempi di Cytokinetic Eventi a S. pombe. (A) Montaggio di una esprimere Spindl cellularee marcatore corpo pole sad1-mCherry (pannello di sinistra), proteina anello Rlc1-GFP (pannello centrale) e in campo chiaro (pannello di destra) sottoposti cytokinesis è mostrato ad intervalli di 2 min. Frecce bianche segna mandrino corpo (centrosome) separazione pole a 17 min, la freccia rossa indica l'assunzione iniziale di Rlc1-GFP al sito di divisione, aperto segni freccia anello maturazione a 27 min, punta di freccia segna insorgenza di anello di costrizione a 47 min, marchi di asterischi fine di anello di costrizione a 69 min e punta di freccia rossa segna escissione cellulare a 97 min. (B) Timeline degli eventi cytokinetic con riferimento alla mitosi come determinare dalla formazione del corpo palo fuso e la separazione. Le cellule sono state ripreso a 25 ° C. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Cell Divisione del sito durante le diverse fasi di Citochinesi. ricostruzione 3D di anello actomiosina Z-stack durante le diverse fasi della cytokinesis per la stessa cella, il montaggio anello (10 min dopo poli mandrino corpo di separazione), maturazione anello (30 min post-separazione del mandrino polo corpo), costrizione anello (palo mandrino 40 min la separazione del corpo), fine della costrizione (50 min dopo polo mandrino separazione del corpo), la barriera del setto (60 min dopo polo mandrino separazione del corpo). Rlc1-pomodoro segna anello mentre Bgs1-GFP segna la membrana plasmatica che avvolge il setto. Barra di scala = 5 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4: distribuzione delle proteine lungo l'anello. Immagini di 3D ricostruite anello actomiosina da wild type cells esprimono Cdc15-GFP diviso in quattro quadranti. Il coefficiente di varianza di ogni anello è indicato. Barra di scala = 5 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.