Sistema di coltura di organo del grasso corporeo in Aedes Aegypti, vettore di Virus di Zika

Le zanzare sono vettori di malattie umane devastanti, tra cui la malaria, la febbre dengue, chikungunya e Zika^1,2,3. Nonostante gli sforzi internazionali intensi per frenare queste malattie e per controllare le popolazioni di zanzara trasmette la malattia, scoppi epidemici di malattie trasmesse dalle zanzare sono ancora comuni, soprattutto nei paesi in via di sviluppo. Vaccini efficaci contro molte di queste malattie sono disponibili o di efficacia limitata^4,5. Il modo più efficace per prevenire focolai è quello di controllare le popolazioni di zanzare, soprattutto attraverso l'uso di trattamenti insetticidi. Tuttavia, resistenza agli insetticidi ha sviluppato in molte popolazioni di zanzare e diventato un problema comune in tutto il mondo^6,7,8. Lo studio della fisiologia di zanzara è essenziale per lo sviluppo di nuovi strumenti e strategie per controllare la malattia.

Il corpo di grasso di zanzara svolge un ruolo centrale nel deposito dei nutrienti, omeostasi metabolica, riproduzione e xenobiotici catabolismo^9,10,11,12. È l'organo principale di deposito per i trigliceridi, glicogeno e aminoacidi in forma di proteine di deposito. Funziona inoltre come la posizione di sintesi per la maggior parte delle proteine di emolinfa e metaboliti. Nelle zanzare, il grasso corporeo è l'unica fonte di produzione di proteine di tuorlo che si verifica nelle femmine dopo prendono un pasto di sangue^13,14.

Il tipo delle cellule principali del corpo grasso è la trophocyte grande, poliploidi o del adipocyte^3,9,10,12. Tessuto grasso corporeo è organizzato in lobi o guaine e può essere trovato in tutte le parti del corpo della zanzara, con la più grande parte situata nell'addome, dove grandi lobi di grasso corporeo sono attaccati alla parete addominale del corpo.

Il sistema di cultura del corpo grasso zanzara presentato qui è stato sviluppato negli anni ' 70 e rimane un potente strumento per lo studio della fisiologia grasso corpo¹⁰, specialmente in combinazione con le attuali tecnologie di analisi. La Fondazione di questa tecnica è basata sull'isolamento delle pareti addominali corpo e tessuto grasso associato. La natura idrofobica della cuticola addominale induce a galleggiare sulla superficie del terreno di coltura, con i lobi associati del corpo grasso addominale immersi. La struttura tracheolar e gli spiracoli sono tenute, garantendo l'ossigenazione del tessuto coltivato. D'ora in poi, si farà riferimento a queste preparazioni come "corpi grassi." Corpi di grasso isolati rimangono vitali per più di 12 h quando incubate nel mezzo appropriato (dati non pubblicati). Cultura del grasso corporeo è uno strumento prezioso che ha affrontato una serie di domande per quanto riguarda il corpo grasso endocrinologia e fisiologia^{9,10,12,15,16, 17}.

Corpi grassi coltivati possono essere sottoposti a vari sperimentale e controllo trattamenti, la tempistica di cui può essere decisa dallo sperimentatore. Alla fine del periodo d'incubazione, i corpi di grasso possono essere raccolti ed elaborati per analisi successive, tra cui qPCR^16,17,18,19, Western blotting^{18 ,20}, proteomica²¹o²²di metabolomica. Esperimenti possono essere eseguiti su scale diverse, da singoli corpi grassi a gruppi di centinaia che possa essere coltivate insieme.

I risultati rappresentativi inclusi in questa sezione sono stati derivati da corpi grassi coltivati in presenza di aminoacidi e l'ecdisone 20-idrossi ormone steroide per simulare l'attivazione di pasto di sangue di vitellogenesi^{16,17, 23,24}. Abbiamo analizzato e confrontato l'espressione genica differenziale di non-attivato contro corpi grassi attivati attraverso l'analisi di sequenziamento di nuova generazione.

1. preparazione delle soluzioni e dei reagenti

1. soluzione di riserva dell'amminoacido
   1. preparare un 4 X amminoacido soluzione stock ^{23 , 24} di pesatura e l'aggiunta di 20 aminoacidi differenti per un matraccio di Erlenmeyer secondo le concentrazioni riportati nella tabella 1.
      Nota: In alcuni casi, amino acid(s) possono essere esclusi dalla soluzione e sostituito da uguali quantità molare di mannitolo per mantenere una concentrazione uguale di osmolytes.
   2. Aggiungere la quantità appropriata di ddH ₂ O per produrre il volume desiderato della soluzione.
   3. Per garantire che gli aminoacidi hanno completamente dissolto, scaldare leggermente, mescolando continuamente fino a quando il liquido è completamente chiaro; ci vorrà da una leggera tonalità gialla.
      Nota: Potrebbe essere necessario ridurre il pH a 6 con l'aggiunta di HCl per consentire alcuni degli aminoacidi più idrofobi per dissolvere.
   4. Dimensione del poro aliquotare la soluzione e filtro sterile utilizzando un siringa filtro con un-0,2 µm.
   5. Store in un contenitore sigillato a-20 ° C fino a 6 mesi.
2. APS
   Nota: vedere ²⁵.
   1. Per 20 X soluzione stock di sale, unire i sali elencati nella tabella 2 in 50 mL di acqua. Mescolare fino a completa dissoluzione.
      Nota: Potrebbe essere necessario riscaldare leggermente la soluzione per sciogliere completamente i sali.
   2. Filtro Sterile utilizzando un siringa filtro con un-0,2 µm dimensione dei pori e conservare la soluzione in un tubo da 50 mL a -20 ° C.
3. Soluzione di riserva di calcio
   1. per i 50 X soluzione di riserva di calcio, aggiungere 0,90 g di cloruro di calcio per 100 mL di acqua (tabella 3); mescolare fino a completa dissoluzione.
   2. Utilizzando una siringa Sterile-filtro del filtro con un diametro dei pori da 0,2 µm, aliquota la soluzione nelle provette da 50 mL e conservare a -20 ° C.
4. Tampone Tris (pH 7,4)
   1. per il Tris buffer, unire il sale e le soluzioni elencate in tabella 4 e aggiungere ddH ₂ O fino a 100 mL.
   2. Utilizzando una siringa Sterile-filtro del filtro con un diametro dei pori da 0,2 µm e aliquota la soluzione nelle provette da 50 mL; conservare a temperatura ambiente.
5. Terreno di coltura di corpo grasso
   1. per preparare il terreno di coltura del grasso corporeo, preparare tutte le soluzioni elencate in precedenza.
   2. Combinarli secondo i volumi in tabella 5 per fare 200 mL di terreno di coltura del grasso corporeo.
   3. Aggiustare il pH a 7,2 con NaOH o HCl.
   4. Filtro Sterile la soluzione utilizzando un siringa filtro con un diametro dei pori da 0,2 µm.
   5. Dividere la soluzione in 15 mL aliquote e conservare a-20 ° C fino a 6 mesi.

2. Preparazione per la dissezione

1. preparare uno stereomicroscopio (ingrandimento x 10-20) con illuminazione e stendere due pinzette ultra-sottili e un paio di forbici micro dissezione.
2. Preparare tutte le soluzioni necessarie per l'esperimento. Scongelare il terreno di coltura di corpo grasso a temperatura ambiente.
   Nota: Precipitanti possono essere dissolto riscaldando delicatamente la soluzione per non superiore ai 30 ° C.
3. Con un aspiratore, raccogliere le zanzare femmina adulte (3-7 giorni dopo l'emersione) e anestetizzare li utilizzando anidride carbonica o Ice.
   Nota: Una volta anestetizzato, le zanzare devono essere tenute sotto CO ₂ per il minor tempo possibile, non superiore a 20 min. in alternativa, le zanzare possono essere anestetizzate sul ghiaccio e tenute per circa 30 min.
4. Preparare una piastra a 6 pozzetti con 3 mL di APS per pozzetto.

3. Dissezione del corpo grasso

1. lo stereomicroscopio per dissezione a fuoco e regolare la sedia ad un'altezza confortevole.
2. Mettere un vetrino concavo sulla superficie del microscopio e aggiungere due gocce di APS al centro.
3. Pick up una zanzara di una gamba per mezzo di un forcipe e trasferirlo sulla superficie di APS sul vetrino da microscopio.
4. Attentamente afferrare la zanzara per il torace, con la pinza nella mano sinistra e ruotare la zanzara, in modo che il lato ventrale è verso l'alto.
5. Tenendo il corpo costante di torace, afferrare i due ultimi segmenti addominali, con la pinza nella mano destra e tirare delicatamente.
   Nota: Gli ultimi due segmenti addominali separerà dall'addome e l'annesso ovaie, Malpighian tubuli, del hindgut e del midgut; a volte il raccolto scivolerà fuori l'addome. Se non sono state rimosse, inserire le punte chiuse delle pinze nel piccolo foro creato e rimuovere i restanti tessuti.
6. Accantonare la pinza destra e prendere le forbici di primavera. Infilare una lama nel foro nell'addome fino al segmento sotto il torace. Delicatamente e rapidamente tagliare longitudinalmente l'addome.
   Nota: Una volta effettuato il taglio, l'addome dovrebbe cominciare ad espandere verso l'esterno, anche se questo potrebbe non verificarsi immediatamente.
7. Procedere per rendere il secondo taglio, che sarà un taglio laterale sotto il torace e leggermente di sotto di dove si è concluso il primo taglio.
   Nota: L'addome dovrebbe quindi aprire e dissociare dal torace, con la cuticola fino e i corpi di grasso lato-immersi all'interno l'APS. Questa corpo della parete addominale è la preparazione del grasso corporeo per la coltura in vitro.
8. Sollevare i corpi grassi dalla soluzione APS con la punta di un paio di pinze e trasferirli dalla soluzione alla piastra 6 pozzetti contenenti APS a temperatura ambiente. Consentire il tessuto a riposare per circa 0,5 h prima di avanzare la cultura del grasso corporeo.

4. Cultura del grasso di corpo

1. Incubare i corpi grassi su APS a temperatura ambiente per almeno 0,5 h equilibrare li.
2. Trasferire i corpi grassi usando la punta delle pinze e sollevare delicatamente li fuori la soluzione APS. Abbassare la punta nel terreno di coltura del grasso corporeo.
   Nota: Il grasso corporeo dovrebbe aprire sulla superficie del mezzo e galleggiare liberamente. La cultura del grasso corporeo viene in genere eseguita in piastre da 96 pozzetti, con 150-200 µ l di terreno in ciascun pozzetto. Uno ben può montare fino a tre singoli corpi grassi, e sono valide per più di 12 h (risultati personali non pubblicati).
3. Dopo il periodo di incubazione, trasferire i corpi grassi dal mezzo in provette da 1,5 mL Centrifuga contenente i reagenti appropriati per l'elaborazione a valle.
   Nota: Analisi tipiche includono qPCR ^{16 , 17 , 18 , 19}, Western blotting ^{18 , 20}, ²⁶ di trascrittomica, proteomica ²¹ o metabolomica ²².

Ad esempio, abbiamo eseguito un esperimento di cultura del grasso corporeo e stimolato corpi grassi isolati da incubarle in una soluzione contenente una miscela equilibrata di tutti i venti amminoacidi naturali e l'ecdisone 20-idrossi insetto dell'ormone steroide (10 µM) per 6 h . Come controllo, corpi grassi sono stati incubati su APS per un uguale periodo di tempo.

Dopo l'incubazione, il RNA totale è stato isolato mediante un tri-reagente27 seguendo le istruzioni del produttore. La qualità e la quantità di campioni di RNA estratti sono stati valutati utilizzando un spettrofotometro, fluorometrica e l'elettroforesi del gel dell'agarosi. Librerie di sequenziamento di RNA sono state generate utilizzando 4 µ g di RNA totale e sono state quantificate utilizzando due tecniche differenti. Successivamente, le librerie sono state inviate a un provider commerciale per fine-sequenziamento accoppiato.

I risultati di questo esperimento sono riportati nella tabella 6. Geni che mostra la più forte risposta trascrizionale dell'aminoacido e 20-hydroxyecdysone erano principalmente tuorlo geni della proteina, che è in accordo con precedenti risultati11.

La figura 1 Mostra una mappa di calore che indica i livelli di espressione genica di 1.256 differenzialmente espressi geni da corpi grassi coltivati dopo due trattamenti diversi.

Figura 1 . Mappa di calore di geni espressi nella cultura del grasso corporeo. La mappa di calore è stata calcolata in base al numero di specifici trascritti per ogni gene in librerie diverse utilizzando heatmap pacchetto28 che è parte dell'ambiente software R. La tonalità più scura rappresenta la maggiore espressione del gene. 1.256 geni con variazione statisticamente significativa nell'espressione (valori di Q < 0.05) vengono visualizzati. I geni sono ordinati secondo i loro livelli di espressione media, indicati dal dendrogramma sulla sinistra (non secondo il loro relazioni filogenetiche). Si noti l'elevato numero di geni con espressione up - o down-regolati dopo stimolazione con gli aminoacidi (AA) e 20-hydroxyecdysone (20E). APS = Aedes fisiologica. Per un elenco dei geni e dei loro livelli di espressione relativa, vedere Supplemental File 1 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1. 4 x soluzione stock dell'aminoacido.

Tabella 2. 20 X sale soluzione stock.

g > tabella 3. 50 x soluzione stock calcio.

Tabella 4. Tampone Tris.

Tabella 5. Terreno di coltura del grasso corporeo.

Tabella 6. Risultati sperimentali.

File supplementare 1. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Non abbiamo nulla di divulgare.