Research Article
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Vi presentiamo un protocollo per misurare il consumo di ossigeno e l'acidificazione extracellulare nei cervelli di larve e adulti di Drosophila melanogaster . Un analizzatore metabolico è utilizzato con un protocollo adattato e ottimizzato. Vincoli di micro-tessuto sono una componente fondamentale del presente protocollo e progettate e create appositamente per il loro uso in questa analisi.
Questo protocollo descrive un metodo per misurare il metabolismo nel cervello di Drosophila melanogaster larvale e adulto. Quantificazione del metabolismo in organi interi fornisce una comprensione a livello del tessuto di utilizzazione di energia che non può essere catturato quando si analizzano le cellule primarie e linee cellulari. Mentre questa analisi è ex vivo, esso consente la misurazione da un numero di cellule specializzate che lavorano insieme per eseguire una funzione in un tessuto e modelli più da vicino l'organo in vivo . Riprogrammazione metabolico è stato osservato in molte malattie neurologiche, compreso neoplasia e malattie neurodegenerative. Questo protocollo è stato sviluppato per assistere l'indagine della Comunità d. melanogaster del metabolismo nei modelli di malattia neurologica usando un analizzatore metabolico commercialmente disponibile. Misurazione del metabolismo del cervello intero nell'analizzatore metabolico è impegnativo a causa della geometria del cervello. Questo analizzatore richiede campioni di rimanere nella parte inferiore di una piastra a 96 pozzetti. Campioni di cellule e tessuti pugni possono aderire alla superficie della piastra cellulare o utilizzare piastre sferoide, rispettivamente. Tuttavia, la forma sferica, tridimensionale dei cervelli di d. melanogaster impedisce il tessuto di aderire alla piastra. Questo protocollo richiede una moderazione di micro-tessuto appositamente progettato e fabbricato che aggira questo problema impedendo qualsiasi movimento del cervello pur consentendo misurazioni metaboliche da due sonde sensore a stato solido dell'analizzatore. Consumo di ossigeno e tassi di acidificazione extracellulare sono riproducibili e sensibili ad un trattamento con inibitori metabolici. Con una minore ottimizzazione, questo protocollo può essere adattato per l'uso con qualsiasi tessuto intero e/o sistema modello, purché la dimensione del campione non superi la camera generata dal sistema di ritenuta. Mentre misure metaboliche basale e un'analisi dopo un trattamento con inibitori mitocondriali sono descritte all'interno di questo protocollo, innumerevoli condizioni sperimentali, come preferenza di fonte di energia e ambiente di allevamento, potranno essere interrogate.
Riprogrammazione metabolica è stata identificata in molte malattie neurologiche, compreso il Glioblastoma Multiforme (GBM), malattia di Huntington e disturbo depressivo maggiore (MDD)1,2,3. Come metabolismo diventa il fulcro delle strategie terapeutiche, strumenti per la ricerca di base metabolica hanno avanzato. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi sono stata progettata per lo studio di linee cellulari e cellule primarie o per analizzare più grandi tessuti post-fissazione o - congelamento. Alcuni approcci hanno contato sui kit per misurare semplicisticamente specifici metaboliti, mentre altri hanno utilizzato più costose e complesse analisi che utilizza cromatografia in combinazione con spettrometria di massa4 per lo stesso obiettivo. Per capire il più grande paesaggio metabolico, metabolica profilatura5,6 e analisi di cambiamento continuo metabolico (MFA)7 è emerso per completare la proteomica su larga scala e studi genomici. Profilatura fornisce una rappresentazione quantitativa di metaboliti in una cella o un tessuto ad un certo punto nel tempo, mentre MFA si espande su questo consentendo il monitoraggio dei metaboliti identificati nel corso del tempo. Quest'ultimo è stato utile nel rivelare come fonti di energia vengono utilizzate in modo diverso in una cella o un tessuto quando in una malattia statale8. Tuttavia, questi metodi non includono la misurazione del tasso metabolico in generale.
Per interrogare lo stato metabolico nel complesso dei sistemi modello piccolo, i metodi tradizionali, come l' elettrodo di Clark9 e la calorimetria indiretta10, possono essere utilizzati per misurare il consumo di ossigeno o configurati per fermata manometrica di flusso, per misura dell'ossigeno e la concentrazione di biossido di carbonio, rispettivamente. Queste tecniche, fornendo con precisione spaccato la lettura della riprogrammazione metabolica a livello di organismo, hanno limitazioni. L'uso dell'elettrodo di Clark può essere tecnicamente impegnativo e non è progettato per gli studi di alto-rendimento. Il respirometro flusso fermata non può funzionare con la sensibilità necessaria per analisi di cellule o tessuti. Diversi anni fa, nuova tecnologia è stata sviluppata appositamente per queste applicazioni più piccole11. Questi strumenti sono stati inizialmente progettati per misurare il consumo di ossigeno e l'acidificazione extracellulare di linee cellulari e cellule primarie in un formato di 24 o 96 pozzetti. La semplicità dell'output set-up e dati stabilito questo metodo come alternativa agli approcci tradizionali. Questa metodologia è uno strumento potente per le cellule e gli avanzamenti recenti hanno permesso per la misurazione del tessuto punzoni12,13,14. Tuttavia, i metodi utilizzati in questi esperimenti non consentono la misurazione di organi interi da sistemi modello piccolo.
L'analisi metabolica dei modelli di malattia coinvolge spesso l'interazione tra cellule di funzione specializzata che risiedono all'interno del tessuto stesso. Ad esempio, le cellule gliali producono metaboliti utilizzati dai neuroni. Queste interazioni metaboliche sono necessari per la sopravvivenza neuronale15. Sistemi modello piccolo sono vantaggiosi per indagare questioni come queste. Studi per misurare il metabolismo di un intero organo, che contiene una varietà di tipi cellulari, aggiungerà alla comprensione dell'energia l'utilizzo in vivo. Recentemente, Becker et al ha segnalato un metodo di misurazione del consumo di ossigeno in tutta Mosca teste16. Unendo un numero di teste insieme in un pozzetto di una piastra di cella 24 pozzetti, letture di consumo di ossigeno sono state ottenute utilizzando un analizzatore metabolico. Mentre questo funziona bene per teste, che sono facilmente separate dal corpo, è molto più difficile da usare per organi quali cervello larvale, perché una grande quantità deve essere sezionato per questo metodo. Di conseguenza, un metodo che utilizza una piastra a 96 pozzetti delle cellule, che aumenta la sensibilità del consumo di ossigeno e letture di acidificazione extracellulare, è stato sviluppato per analizzare un singolo cervello intero larvale.
L'analizzatore metabolico utilizzato in questo studio richiede il campione da misurare per rimanere nella parte inferiore del pozzo di una piastra a 96 pozzetti delle cellule. Per cellule e tessuti relativamente piatte, questa non è una sfida; Tuttavia, per i cervelli larvali e adulti di d. melanogaster , non è possibile utilizzando protocolli di rivestimento del piatto tradizionale. La forma sferica tridimensionale dei cervelli in modo affidabile non aderisca alla superficie della placca, e quelli che lo fanno sono spesso danneggiati durante il tentativo di inserirli correttamente nel pozzo. Una parte fondamentale di questo nuovo protocollo è la progettazione e lo sviluppo di micro-tessuto vincoli17 che forniscono una piccola camera per il cervello a risiedere in senza interferire con le misurazioni metaboliche. La camera generata è circa 0,016 in altezza e offre spazio sufficiente per contenere facilmente molti cervelli di d. melanogaster . I vincoli sono costituiti da maglia di nylon attaccata un anello di polimero inerte e sarà discusso ulteriormente nei Risultati di rappresentante. Utilizzando questi vincoli riduce al minimo il tempo necessario per preparare i cervelli sezionati per la misurazione metabolica. Ottimizzare la procedura di misurazione genera il consumo di ossigeno costante, riproducibile e tassi di acidificazione extracellulare dopo sei cicli di misura (di 25 min). I cervelli rimangono metabolicamente attivi in queste condizioni per un minimo di 2 h, che consente di utilizzare iniezioni di terapeutica, inibitori o altri trattamenti tramite l'analizzatore metabolico cartuccia droga consegna porte. Questo protocollo può anche essere facilmente adattato per altri tessuti e piccolo modello sistemi18.
Il protocollo descritto di seguito viene descritto come analizzare il consumo di ossigeno in un intero cervello larvale della drosofila quando sfidato con sforzo mitocondriale. Per sottolineare il cervello, oligomycin è aggiunto per inibire la ATP sintasi19. La diminuzione nel consumo di ossigeno da letture basale Mostra una misura della quantità di ATP, a seconda di respirazione nel cervello. Ulteriori diminuzioni del consumo di ossigeno dopo trattamenti con rotenone20 e antimycin A21, inibitori dei complessi della catena di trasporto degli elettroni, I e III, rispettivamente, indicano la quantità di consumo di ossigeno non mitocondriale nella cervello. Questo test è un esempio di respirazione come mitocondriale in un cervello Vola potrebbe essere confrontato e come questo protocollo può essere usato per confrontare il metabolismo in diversi genotipi. Tuttavia, questo protocollo può essere adattato per misurare il consumo di ossigeno semplicemente basale e tassi di acidificazione extracellulare, nonché progettare più elaborati studi che studiano l'utilizzo dell'energia specifica o ipotesi di utilizzazione del substrato.
1. metodo del dosaggio preparazione (giorno 1)
2. analisi Media preparazione (giorno 2)
3. installazione del Software per l'analisi metabolica dei cervelli Drosophila melanogaster (Day 2)
4. preparazione della cartuccia per la calibrazione (giorno 2)
5. preparazione delle restrizioni di Micro-tessuto (giorno 2)
6. dissezione di Drosophila melanogaster larvale cervelli (giorno 2)
7. aggiunta dei cervelli sezionati alla piastra 96 pozzetti metabolica Assay (giorno 2)
8. l'aggiunta di Micro-tessuto vincoli alla piastra 96 pozzetti metabolica analisi delle cellule (giorno 2)
9. aggiunta della piastra delle cellule per l'analizzatore metabolico e l'inizio del test (giorno 2)
10. post-misurazione analisi (giorno 2)
Il protocollo qui presentato richiede l'utilizzo di vincoli di micro-tessuto che soddisfano le specifiche descritte di seguito. Utilizzare altri metodi per tenere il cervello a posto nella parte inferiore della piastra 96 pozzetti cella era infruttuoso (Figura 2A e 2B). In primo luogo, sono stati testati vari agenti per aumentare l'aderenza del tessuto alla piastra. Un adesivo del tessuto disponibile in commercio (Tabella materiali) è raccomandato per l'uso di cellule e organoids con piastre di cella e piastre sferoide, rispettivamente. Inizialmente, cervelli sembravano aderire alla superficie ben; Tuttavia, le letture di consumo (OCR) di ossigeno erano basse, e osservando i pozzetti dopo l'analisi ha rivelato che i cervelli sono stati non più attaccati alla superficie ben (Figura 2A). Gli stessi risultati si sono verificati con colla super (Figura 2A). Avanti, schermi di piccole dimensioni per contenere i cervelli all'interno di una piccola camera nella parte inferiore del pozzo è stata tentata di produzione (Figura 2B).
Schermi di metallo prodotto alte letture OCR da solo, come ha fatto in metallo schermi con un anello di polimero che tiene lo schermo in posizione (Figura 2B). Pezze di rete di plastica è stata utilizzata con lo stesso anello di polimero. Questo dispositivo ha causato una lettura OCR negativa essere ottenuti. Infine, micro-tessuto vincoli sono stati progettati utilizzando un polimero inerte per l'anello misura un diametro esterno di 0,146 in, un diametro interno di 0.1335 in, uno spessore di 0,0125 in e un'altezza di 0,016 in (Tabella materiali). Colla super (Tabella materiali) è stata utilizzata per fissare l'anello di una rete di nylon con un specifico dei pori di 0,0039 in diametro (Tabella materiali). La dimensione dei pori è critica, in quanto permette lo scambio di media e metabolita senza formazione di bolle d'aria, ma ancora agisce come una barriera per i cervelli. Questi vincoli solo provocare poco o nessun OCR lettura e quando utilizzato con il cervello, consentono letture riproducibile (Figura 2A e 2B). La verifica dopo il test ha mostrato che i cervelli erano ancora posizionati correttamente nei pozzetti. Questi vincoli di tessuto non sono attualmente disponibili in commercio, ma possono essere prodotte seguendo le specifiche di cui sopra. Mentre questo richiede fabbricazione precisa, maggior parte dei negozi di macchina sarà in grado di riprodurre questo fermo utilizzando i materiali di cui sopra.
Il protocollo è stato ulteriormente ottimizzato al conto per il supporto di test, il tempo consentita prima di eseguire l'analisi e la temperatura (Figura 3). Inizialmente, le analisi sono stata istituite nel medium Schneider modellare l'ambiente larvale in vivo . Tuttavia, i supporti utilizzati non possono contenere agenti di buffering poiché pH è usato per misurare l'ECAR. Questo media, pertanto, deve essere personalizzato fatto, che è costosa. Per ottimizzare questo, una media di dosaggio disponibili in commercio progettato per analisi metabolica (Tabella materiali) è stato usato al posto dei media di Schneider. I livelli di OCR erano immutati, anche quando l'aumento dei livelli di glucosio leggermente in termini di modello analisi media (Figura 3A). Tutte le analisi da questo punto in poi sono state condotte nel medium di analisi. I supplementi ai media sono stati ottimizzati osservando se il consumo di ossigeno e i tassi di acidificazione extracellulare ha mostrato una risposta quando trattati con inibitori noti mitocondriali. Successivamente, è stato analizzato il tempo di attesa tra le dissezioni e le esecuzioni di test. Un'incubazione di 3 h caduto significativamente i livelli di OCR (Figura 3B). Figura 3D dimostra la differenza presso il sesto punto di tempo, ovvero quando i livelli di OCR ed ECAR stabilizzano al posto del cervello sia in adulti e larve. Così, il protocollo indica per iniziare il test immediatamente dopo le dissezioni, a meno che l'esperimento richiede un equilibrio di temperatura, in cui è suggerito caso un'incubazione per meno di 30 min. L'analizzatore metabolico è memorizzato in un incubatore impostato a 11 ° C per consentire una temperatura di 25 ° C durante tutto il test. Se le temperature sono elevate a causa della temperatura ambiente e funzionamento dello strumento, livelli ridotti di OCR sono osservati (Figura 3). Questo è supposta per essere a causa di morte del tessuto.
Quando le condizioni ottimizzate sono seguite, i saggi con il larvale e adulto cervelli risultato nelle letture di OCR leggermente superiore a 150 pmol/min presso lo stabilizzato tempo sesto punto, ~ 25 min in test (Figura 4B). Questo tasso è mantenuto per almeno 30 min (Figura 4A) e fino a 2 h (dati non mostrati). L'ECAR è leggermente inferiore nel cervello adulto rispetto nei cervelli larvali presso il sesto punto di tempo (Figura 4) e viene mantenuto per almeno 30 min (Figura 4). Questo risultato corrisponde ad un aumento nella glicolisi durante gli stadi larvali per sostenere la crescita. Un'iniezione con un inibitore mitocondriale, come oligomycin, abbassa le letture di OCR per rivelare la respirazione di ATP-dipendente e ulteriore trattamento con rotenone e antimycin A abbassa l'OCR per rivelare il consumo di ossigeno non mitocondriale (Figura 5A ). Questi dati dimostrano che questi inibitori sono in grado di penetrare il tessuto cerebrale e possono essere utilizzati per confrontare la respirazione mitocondriale nei cervelli dei vari genotipi. Per questo test, il mix, aspettare, e tempi di misura sono state ottimizzate osservando i livelli di ossigeno, non il tasso di consumo, e garantire che dopo la miscelazione, il livello di ossigeno rinviato al livello precedente la misura.
Figura 1: schema delle misurazioni di OCR ed ECAR larvale cervello nell'analizzatore metabolico. La cartuccia viene preparata un giorno prima per l'esecuzione del dosaggio. Il giorno successivo, farmaci vengono aggiunti per i porti di iniezione della cartuccia. D. melanogaster larvali cervelli vengono sezionati e micro-tessuto vincoli vengono aggiunti per garantire il cervello sul fondo del pozzo. Alla piastra con i cervelli è analizzata nell'analizzatore metabolico e i dati vengono analizzati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Micro-tessuto vincoli non sono metabolicamente attive e tenere il cervello in una camera nella parte inferiore di una piastra ben. (A) The OCR dei cervelli larvali Oregon-R D. melanogaster è misurata in pozzetti sensibilizzati con adesivo del tessuto (Tabella materiali) o quando i cervelli sono super incollati al fondo del pozzo. I risultati sono paragonati a quelli dei cervelli posizionati nella parte inferiore del pozzo utilizzando micro-tessuto restrizioni. (B) The OCR è misurata in pozzetti contenenti analisi media e metallo, metallo con un anello di polimero, pezze di rete di plastica e un anello di polimero o vincoli di micro-tessuto. p-valore < 0.05, * * p-valore < 0.01, * * * p-valore < 0,001, * * * p-valore < 0,0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: ottimizzazione dei media, tempo di incubazione e temperatura. (A) The OCR è misurata in Oregon-R D. melanogaster larvali cervelli utilizzando media Schneider (S2) con piruvato di sodio aggiunto, S2 con glucosio e sodio piruvato aggiunto e analisi media con glucosio e sodio piruvato aggiunto. (B) The OCR è misurato in cervelli larvali dopo 3 h di incubazione prima del dosaggio, o dopo 30 min di incubazione prima del dosaggio. (C) The OCR è misurato in cervelli larvali alle analisi del saggio temperatura di 33 ° C e 25 ° C. Il sesto punto di tempo è rappresentato graficamente. (D) The OCR è misurato in cervelli larvali dopo 3 h di incubazione prima del dosaggio, o dopo 30 min di incubazione prima del dosaggio. I dati sono segnalati per il sesto punto di tempo. p-valore < 0.05, * * p-valore < 0.01, * * * p-valore < 0,001, * * * p-valore < 0,0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: L'OCR ed ECAR riproducibile sono misurati in adulto e larvale d. melanogaster cervelli. (A) The OCR viene misurata nel cervello adulto e larvale Oregon-R D. melanogaster , per 30 min (B) dati di The OCR del sesto punto tempo da pannello A sono rappresentato graficamente. Questo è il punto di tempo in cui le letture OCR stabilizzano. (C) The ECAR viene misurata nel cervello adulto e larvale di d. melanogaster , per 30 min (D) dati di The ECAR del sesto punto tempo dal pannello A sono rappresentato graficamente. Questo è il punto di tempo in cui le letture di ECAR stabilizzano. p-valore < 0.05, * * p-valore < 0.01, * * * p-valore < 0,001, * * * p-valore < 0,0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Oligomycin abbassa i livelli di cervello larvale OCR di d. melanogaster per rivelare la respirazione ATP-dipendente, e un ulteriore di rotenone e antimycin abbassa l'OCR per rivelare il consumo di ossigeno non mitocondriale. (A) The OCR è misurata in Oregon-Rd. melanogaster larvali cervelli dopo un trattamento con un 20 µM oligomycin e miscela di rotenone/antimycin A 5 µM. Il controllo e la sola ritenuta pozzi sono stati iniettati con media di dosaggio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
M. Tipping detiene un brevetto provvisorio per le restrizioni di micro-tessuto descritto in questo protocollo17.
Vi presentiamo un protocollo per misurare il consumo di ossigeno e l'acidificazione extracellulare nei cervelli di larve e adulti di Drosophila melanogaster . Un analizzatore metabolico è utilizzato con un protocollo adattato e ottimizzato. Vincoli di micro-tessuto sono una componente fondamentale del presente protocollo e progettate e create appositamente per il loro uso in questa analisi.
Titoli ottenuti da Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018637) sono stati utilizzati in questo studio. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dalla rete istituzionale Development Award (IDeA) per eccellenza di ricerca biomedica dal National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health, sotto concessione numero P20GM103430 e dalla Fondazione Rhode Island. Autori ringraziano J. Waters e P. Snodgrass-cintura per il loro supporto nello sviluppo di questo protocollo.
| Terreno di prova | Agilent | 102365-100 | |
| Soluzione calibrante | Agilent | 100840-000 | |
| Corning Cell-Tak Cell Tissue Adhesive Sigma | Aldrich | DLW354240 | |
| delrin | Grainger | 2XMK6 | |
| Drosophila Schneider Media | Thermo Fisher | 21720-024 | |
| Dumont High Precision Pinzette (stile 5) | Ted Pella | 5622 | |
| Loctite 409 | Amazon | ||
| Mitostress kit | Agilent | 103015-100 | oligomicina, rotenone e antimicina A inclusi |
| Inserti Netwell (6 pozzetti) | Rete di nylonVWR | 29442-136 | |
| Fornitura di componenti | U-CMN-64 | ||
| Pellicola di avvolgimento Parafilm M | Fisher Scientific | S37440 | |
| Piastra spot PYREX | Fisher Scientific | 13-748B | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Software per l'analisiAgilent | ||
| Wave v2.4 XFe96 | Agilent | https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop | download gratuito su mac o windows |
| XFe96 catridge e piastre cellulari | Agilent | 102416-100 |
