Summary

Isolamento dei Glomeruli e In Vivo di etichettatura delle proteine di superficie delle cellule glomerulari

Published: January 18, 2019
doi:

Summary

Qui presentiamo un protocollo per l’etichettatura dei Murina in vivo delle proteine di superficie delle cellule glomerulari con biotina. Questo protocollo contiene informazioni su come irrorare i reni del mouse, isolare i glomeruli ed eseguire immunoprecipitazione endogena della proteina di interesse.

Abstract

Proteinuria deriva dalla distruzione del filtro glomerulare che è composto dall’endotelio fenestrato e la membrana basale glomerulare podociti con loro fessura diaframmi. La delicata struttura del filtro glomerulare, soprattutto il diaframma a fessura, si basa sull’interazione di proteine della superficie cellulare diversificata. Lo studio di queste proteine di superficie delle cellule è stato finora limitato a studi in vitro o l’analisi istologica. Qui, presentiamo un biotinylation murino in vivo etichettatura metodo, che consente lo studio delle proteine di superficie delle cellule glomerulari in condizioni fisiologiche e patofisiologiche. Questo protocollo contiene informazioni su come irrorare i reni del mouse, isolare i glomeruli ed eseguire endogeno immunoprecipitazione di una proteina di interesse. Semi-quantificazione dell’abbondanza di superficie delle cellule glomerulari è prontamente disponibile con questo metodo novello e tutte le proteine accessibile alla perfusione di biotina e immunoprecipitazione può essere studiato. Isolamento dei glomeruli con o senza biotinylation consente inoltre ulteriori analisi di glomerulare RNA e proteina così come primario delle cellule glomerulari (culturacioè, Podocita primario delle cellule).

Introduction

Proteinuria è un segno distintivo della lesione glomerulare e solitamente accompagna la rottura del filtro glomerulare1. Il filtro glomerulare è composto dell’endotelio fenestrato e la membrana basale glomerulare podociti. La delicata struttura molecolare del filtro glomerulare è altamente dinamico e soggetto a proteina di superficie delle cellule traffico in entrambi i reni sani e malati2,3,4,5,6 . Endocitosi di proteine di superficie delle cellule ha dimostrato di essere essenziale per la sopravvivenza di podociti7. Nefrina e Podocalixina sono proteine transmembrana espresse su podociti. Nefrina è la spina dorsale del diaframma fessura glomerulare, mentre Podocalixina è un sialoglycoprotein rivestimento i processi secondari piede di podociti8,9,10. Endocitico traffico precedentemente è stato indicato per Nefrina e Podocalixina3,11,12,13,14.

Al meglio della nostra conoscenza, endocitosi delle proteine della superficie cellulare ancora non sono stata descritta in cellule endoteliali glomerulari nella letteratura. Tuttavia, le cellule endoteliali esprimono in generale tutte le proteine necessarie per i diversi tipi di endocitosi (cioè, endocitosi clatrina-dipendente, zattera-dipendente)15,16. Pertanto, traffico di superficie delle cellule endoteliali può essere studiato con questo metodo, utilizzando, ad esempio, vascolare endoteliale (VE)-caderina e molecola intracellulare di adesione (ICAM-2) come una cella di superficie proteina marker per cellule endoteliali glomerulari17 .

Purtroppo, non c’è nessun modello preciso in vitro per il filtro glomerulare a tre strati delicato in quale cella può essere studiato il traffico della proteina di superficie. L’obiettivo di questo metodo è così di studiare glomerulare proteine traffico in vivo. Inoltre, questo protocollo contiene informazioni su come isolare i glomeruli, consentendo l’ulteriore analisi di RNA, proteine o cellule glomerulari. Isolamento glomerulare simile tecniche sono state descritte da diversi gruppi di18,19.

In precedenza, noi ed altri abbiamo usato ex vivo etichettatura delle proteine di superficie delle cellule glomerulari di biotinilazione2,3,4,20,21. Tuttavia, in questo metodo ex vivo , glomeruli isolati sono stati esposti a sollecitazioni meccaniche, che possono influenzare il traffico endocitico. In alternativa, immunofluorescenza etichettatura delle proteine di superficie delle cellule glomerulari è stato utilizzato estesamente nella letteratura2,20,22. Con questo metodo, tuttavia, solo un piccolo numero di proteine possa essere analizzato all’interno di una diapositiva, e quantificazione delle immagini di immunofluorescenza è spesso difficile.

Questo metodo di romanzo in vivo offre uno strumento affidabile per lo studio delle cellule glomerulari proteina di superficie abbondanza e traffico accurato in sani e malati reni, e può essere utilizzato in aggiunta al test di immunofluorescenza.

Protocol

Topi sono stati ottenuti come un in-House di razza provenienti dall’impianto di cura degli animali locali o da Janvier Labs in Francia. Le indagini sono state condotte secondo le linee guida descritte nella Guida per la cura e l’uso di animali da laboratorio (US National istituti di salute pubblicazione n. 85-23, rivisto 1996). Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le pertinenti approvazioni istituzionale (dichiari il governo LANUV AZ:84 numero di riferimento-02.04. 2016.A435). <p…

Representative Results

Per isolare i glomeruli con precisione, è necessario irrorare murini reni con PBSCM prima. Aspersione con PBSCM trasforma reni pallidi (Figura 1A). Il embolization di glomeruli con biglie magnetiche saranno visibile come puntini marroni sulla superficie del rene (Figura 1B). Isolamento dei glomeruli con il catcher magnete può mostrare la contaminazione con tubuli renali (Fi…

Discussion

Il metodo proposto permette di successo isolamento dei glomeruli di indagare glomerulare RNA o proteine. Inoltre, colture primarie di cellule glomerulari possono essere eseguite da glomeruli isolati. Se biotina viene applicata prima di isolamento glomerulare, etichettatura delle proteine di superficie delle cellule glomerulari può essere eseguita. Con questo metodo, in vivo delle cellule glomerulari traffico della proteina di superficie possa essere studiato e semi-quantificazione dell’abbondanza di proteine è…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano Blanka Duvnjak per la sua assistenza tecnica eccezionale. Questo lavoro è stato supportato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1 a M.W. e QU280/3-1 a I.Q. Il finanziatore non aveva alcun ruolo nel disegno di studio, raccolta dati, analisi dei dati, decisione di pubblicare e preparazione del manoscritto.

Materials

Motic SMZ168 BL Motic SMZ168BL microscope for mouse surgery
KL1500LCD Pulch and Lorenz microscopy 150500 light for mouse surgery
Rompun (Xylazin) 2% Bayer PZN:01320422 anesthesia
Microfederschere Braun, Aesculap FD100R fine scissors, for cut into the aorta
Durotip Feine Scheren Braun, Aesculap BC210R for abdominal cut
Anatomische Pinzette Braun, Aesculap BD215R for surgery until the abdomen is opened
Präparierklemme Aesculap BJ008R for surgery 
Seraflex Serag Wiessner IC108000 silk thread
Ketamine 10% Medistar anesthesia
Rompun (Xylazin) 2% Bayer anesthesia
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm Portex 800/100/100 Catheter
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm Portex 800/100/200 Catheter
Harvard apparatus 11 Plus Harvard Apparatus 70-2209 syringe pump
EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin Thermo Scientific 21335 biotin
Dynabeads Untouched Mouse T-cells Invitrogen 11413D to embolize glomeruli
Collagenase A Roche 10103578001 to digest kidney tissue
DynaMag-2 Invitrogen 123.21D Magnet catcher
100µm cell stainer Greiner-bio 542000 for glomerular isolation
Axiovert 40 CFL Zeiss non available to confirm glomerular purity
TissueRuptor Quiagen 9002755 Tissue homogenizer
CHAPS Sigma-Aldrich C3023 for lysis buffer
Tris-HCL Sigma-Aldrich T5941 for lysis buffer
NaCl VWR chemicals 27810295 for lysis buffer
NaF Sigma-Aldrich 201154 for lysis buffer
EDTA Sigma-Aldrich E5134 for lysis buffer
ATP Sigma-Aldrich 34369-07-8 for lysis buffer
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225 Follow the manufacturer's instructions
nephrin antibody Progen GP-N2 for westernblot
Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody R&D Systems AF15556-SP for westernblot
Streptavidin Agarose Resin Thermo Scientific 20347 for immunoprecipitation
Protein A sepharose CL-4B GE Healthcare 17096303 for immunoprecipitation
polyclonal rabbit anti-p57 antibody SCBT sc-8298 for Immunohistochemistry
mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74 Sigma-Aldrich A2228 Western blot loading control
rabbit anti-p44/42 cell signalling 4695 for westernblot
Pierce High sensitivity streptavidin-HRP Thermo Scientific 21130 for westernblot
polyclonal mouse ICAM-2 antibody R&D Systems AF774 for westernblot
polyclonal mouse anti-VE-cadherin R&D Systems AF1002 for westernblot

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Königshausen, E., Potthoff, S. A., Haase, R., Meyer-Schwesinger, C., Kaufmann, E., Rump, L. C., Stegbauer, J., Sellin, L., Quack, I., Woznowski, M. Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins. J. Vis. Exp. (143), e58542, doi:10.3791/58542 (2019).

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