Summary

In Vitro modello di differenziazione delle cellule di memoria umana normale B a plasmacellule longevo

Published: January 20, 2019
doi:

Summary

Utilizzando sistemi di coltura di multi-step, segnaliamo un in vitro delle cellule B al modello di differenziazione delle cellule di plasma.

Abstract

Le cellule di plasma (pz) secernono grandi quantità di anticorpi e si sviluppano dalle cellule di B che sono state attivate. PC sono rare cellule situate nel midollo osseo o mucosa e garantire l’immunità umorale. A causa della loro bassa frequenza e la posizione, lo studio dei PC è difficile nell’essere umano. Abbiamo segnalato un B per PC modello di differenziazione in vitro utilizzando combinazioni selezionate di citochine e l’attivazione di molecole che consentono di riprodurre la differenziazione delle cellule sequenziale che si verificano in vivo. In questo modello in vitro, cellule di B (MBCs) differenzierà in pre-plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs), presto PC memoria e infine, longevo pz, con un fenotipo vicino alle loro controparti in individui sani. Abbiamo inoltre sviluppato un accesso aperto bioinformatica strumenti per analizzare le informazioni più importanti dai dati GEP legate alla differenziazione di PC. Queste risorse possono essere utilizzate per studiare umano B alla differenziazione di PC e nello studio corrente, abbiamo studiato la regolazione dell’espressione genica di fattori epigenetici durante B umana alla differenziazione di PC.

Introduction

La differenziazione dei linfociti B a plasmacellule (pz) è essenziale per l’immunità umorale e proteggere l’ospite contro le infezioni1. B alla differenziazione di PC è associata con importanti cambiamenti nel metabolismo e capacità di trascrizione per ospitare a secrezione dell’anticorpo. I fattori di trascrizione che controllano B alla differenziazione di PC sono stati ampiamente studiati e rivelate reti esclusive tra cui trascrizione B – e PC-specifici fattori (TFs)2. In cellule di B, PAX5, BCL6 e BACH2 TFs sono i guardiani delle cellule B identità2,3. Induzione di IRF4, PRDM1 codifica BLIMP1 e XBP1 PC TF sarà estinguere i geni delle cellule B e indurre un coordinato disecrezione cella programma trascrizionale3,4,5. Queste modifiche trascrizionali coordinate sono associate con attivazione di trascrizione di geni Ig insieme con un interruttore dal modulo membrana-limita per la forma secreta della catena pesante dell’immunoglobulina2,3, 4. B alla differenziazione di PC è collegato con l’induzione di geni coinvolti nel reticolo endoplasmatico e Apparato del Golgi funzioni concomitante con l’attivazione di risposta (UPR) spiegata della proteina conosciuta per svolgere un ruolo chiave nel PC ospitando la sintesi di secreto immunoglobuline6,7. Il TF XBP1 svolge un ruolo importante in questo adattamento cellulare8,9,10.

Linfociti B e i PC sono attori chiave della immunità umorale. Comprendere il biologico, i processi che controllano la produzione e la sopravvivenza delle cellule di plasma normale è cruciale in interventi terapeutici che devono garantire efficienti risposte immunitarie e prevenire l’autoimmunità o immunodeficienza. PC sono rare cellule con le fasi iniziali di differenziazione che si svolgono nelle posizioni anatomiche che ostacolano la caratterizzazione biologico completo, particolarmente nell’uomo. Utilizzando sistemi di coltura di multi-step, abbiamo segnalato un B in vitro al modello di differenziazione del PC. Questo modello riproduce il sequenziale di differenziamento e maturazione che si verificano in diversi organi in vivo11,12,13. In una prima fase, le cellule B di memoria sono attivate in primo luogo per quattro giorni da CD40 ligando, oligodeoxynucleotides e citochina combinazione e differenziano in preplasmablasts (PrePBs). In una seconda fase, preplasmablasts sono indotte a differenziarsi in plasmablasts (PBs) rimuovendo la stimolazione CD40L e oligodeoxynucleotides e cambiando la combinazione di citochina. In una terza fase, plasmablasts sono indotte a differenziarsi nei primi PC modificando la citochina combinazione11,12. Un quarto passo è stato introdotto per ottenere pienamente matura pz coltivando questi primi PC con medium condizionate di cellule stromali di midollo osseo o selezionati fattori di crescita13. Questi PC maturi potrebbero sopravvivere parecchi mesi in vitro e secernono una quantità elevata di immunoglobulina (Figura 1). È interessante notare che, il nostro modello in vitro ricapitola le modifiche trascrizionali coordinate e il fenotipo della B diverso a fasi di PC che possono essere rilevati in vivo11,12,13,14 ,15. I PC sono rare cellule e il nostro modello di differenziazione in vitro permette di studiare umano B alla differenziazione di PC.

Protocol

Il protocollo segue le linee guida in conformità con l’accordo del centro ospedale università di Montpellier per le risorse biologiche e la dichiarazione di Helsinki. 1. in Vitro normale modello di differenziazione delle cellule di Plasma Nota: Pezzi vengono generati attraverso una cultura di quattro fasi11,12,13. Differenziazione e amp…

Representative Results

La procedura complessiva di differenziazione in vitro di PC normale è rappresentata nella Figura 1. Utilizzando il protocollo presentato qui, potremmo generiamo un’adeguata quantità di cellule che non potrebbero essere ottenuti con campioni ex vivo umano. Anche se è stato studiato il ruolo della complessa rete di fattori di trascrizione coinvolti nella differenziazione dei PC, i meccanismi che regolano la reti di trascrizione chiave PC differenziazione anc…

Discussion

Negli umani, PC sono rare cellule con fasi di differenziazione che si svolgono in luoghi anatomici che ostacolare la caratterizzazione biologico completo. Abbiamo sviluppato un B in vitro per modello di differenziazione PC utilizzando sistemi di coltura multifase dove varie combinazioni di molecole di attivazione e citochine vengono successivamente applicate al fine di riprodurre il differenziamento sequenziale che si verificano nella diversi organi/tessuti in vivo11,1…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal francese INCA (Institut National du Cancer) Institute (PLBIO15-256), ANR (Tie-Skip) e cancro ITMO (MM & TT).

Materials

anti-CD2 magnetic beads Invitrogen 11159D
Anti-CD138-APC Beckman-Coulter  B49219
Anti-CD19-APC BD 555415
Anti-CD20-PB Beckman-Coulter  B49208
Anti-CD27-PE BD 555441
Anti-CD38-PE Beckman-Coulter  A07779
Anti-histidine R&D Systems MAB050
CpG ODN(PT) Sigma T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*
G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T
human Transferin Sigma-Aldrich T3309
IFN-α Merck Intron A
IMDM Gibco 31980-022
Recombinan Human CD40L-hi R&D Systems 2706-CL
Recombinant Human APRIL R&D Systems 5860-AP-010
Recombinant Human IL-10 R&D Systems 217-IL-
Recombinant Human IL-15 Peprotech 200-15-10ug
Recombinant Human IL-2 Protein R&D Systems 202-IL-
Recombinant Human IL-6 Peprotech 200-06

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Citazione di questo articolo
Jourdan, M., de Boussac, H., Viziteu, E., Kassambara, A., Moreaux, J. In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells. J. Vis. Exp. (143), e58929, doi:10.3791/58929 (2019).

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